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篇1

[關(guān)鍵詞]動物細(xì)胞培養(yǎng)　動物血清

動物細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中要加入動物血清,而其在培養(yǎng)過程中究竟起什么作用,一直是高中教學(xué)的疑點(diǎn)。為了解決這個問題通過查閱相關(guān)資料從血清的成分出發(fā)得出以下結(jié)論。

一、血清及其成分

血清是血液凝固析出的淡黃色透明液體。如將血液自血管內(nèi)抽出,放人試管中,不加抗凝劑,則凝血反應(yīng)被激活,血液迅速凝固,形成膠凍。凝血塊收縮,其周圍所析出之淡黃色透明液體即為血清,也可于凝血后經(jīng)離心取得。從成分上看動物血清的成分主要包括:水90.7血清白蛋白4.4血清球蛋白2.1氨基酸氮0.005尿素氮0.012其他非蛋白氮0.025葡萄糖0.08乳糖0.025各種脂肪酸0.38脂肪0.14卵磷脂0.2膽固醇O,22鈉離子0.38鉀離子0.02鈣離子0.01鎂離子0.0035亞鐵離子0.0001氯離子0.36磷酸氫根離子0.01硫酸根離子0.001碳酸氫根離子0.17DPG SGOT各種激素酶堿基各種氨基酸(以上數(shù)據(jù)均為百分比)。從成分上看血清在動物細(xì)胞培養(yǎng)中的作用是很復(fù)雜的。

二、各成分的功能

1　可以起到營養(yǎng)物質(zhì)的作用

動物在代謝的過程中所需的營養(yǎng)包括水、無機(jī)鹽、維生素、糖類、脂肪、氨基酸和纖維素等。這些成分動物血清都可以提供給體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞,但這些營養(yǎng)物質(zhì)(除水以外)的含量在動物血清中所占的比例很少,而且主要的營養(yǎng)物質(zhì)在動物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制中已經(jīng)添加了。所以,從這些角度看動物細(xì)胞培養(yǎng)加入的動物血清雖然能起到為培養(yǎng)的動物細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)的作用,但這并不是主要的作用。

2　可以起到調(diào)節(jié)的作用

動物細(xì)胞的代謝離不開調(diào)節(jié)。在動物體內(nèi)有兩種調(diào)節(jié)方式來維持動物代謝的穩(wěn)定,而細(xì)胞本身的代謝調(diào)節(jié)中激素調(diào)節(jié)的作用很關(guān)鍵。血清中提供了適量且比例適中的各種各樣的激素來保證動物細(xì)胞離體后的正常代謝。

3　可以為動物細(xì)胞提供必需物質(zhì)

在微生物的培養(yǎng)中要為培養(yǎng)的微生物提供生長因子。同樣動物細(xì)胞代謝過程中有很多物質(zhì)是動物細(xì)胞所必需而自身無法合成的的,例如堿基、維生素、氨基酸等微量物質(zhì),它們的作用非常重要,細(xì)胞需要它們合成核酸和蛋白質(zhì),缺乏-要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡;提供結(jié)合蛋白,能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等,能結(jié)合或調(diào)變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力;,提供對維持細(xì)胞指數(shù)生長的激素,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物,以及主要的低分子營養(yǎng)物。這些物質(zhì)都存在于血清中,如果在配制培養(yǎng)基的時候一項項添加是非常麻煩的。所以加入動物血清類似微生物培養(yǎng)中的天然培養(yǎng)基的做法,簡單方便、效果好。

4　可以為離體的動物細(xì)胞提供能量及解毒功能

血清中存在大量的糖類、脂類物質(zhì),這些物質(zhì)可以為動物細(xì)胞提供大量的能量。有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合,起到解毒作用。

5　是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來源

動物細(xì)胞培養(yǎng)的一個很重要的用途就是用取自燒傷病人皮膚的健康細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),可以獲得大量自身的皮膚細(xì)胞,為大面積燒傷的病人移植。人工皮膚的制備需要培養(yǎng)的細(xì)胞貼附在薄膜上形成皮膚組織,血清就為這個過程提供所需因子。

6　起酸堿度緩沖液作用

在動物血清中存在豐富的無機(jī)鹽,還具有很多緩沖物質(zhì),在培養(yǎng)基的酸堿度發(fā)生變化時起到緩沖作用。

7　提供蛋白酶抑制劑

使在細(xì)胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活,保護(hù)細(xì)胞不受傷害。

總之,動物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基,含有豐富的細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成份,具有極為重要的功能,更重要的是它含有細(xì)胞生長所必須的生長因子、激素、貼附因子等,這是合成培養(yǎng)基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)的毒性。故一般體外培養(yǎng)細(xì)胞時要加入一定量的小牛血清(10%～20%)。

參考文獻(xiàn)

[1]王玢,左明雪等

人體及動物生理學(xué)(第二版)

北京:高等教育出版社、2008

篇2

達(dá)情況，著重觀察單個細(xì)胞培養(yǎng)形成細(xì)胞克隆的形態(tài)與時間。結(jié)果 以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單個細(xì)胞，在96孔板中進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲取12個細(xì)胞亞系（獲取比例為6.25%），均有高成瘤性。癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD44

與ESA均為高水平表達(dá)，而CD184表達(dá)則在12個細(xì)胞系之間有差異。在單個細(xì)胞培養(yǎng)中，形成完全克隆、部分克隆與旁克隆3種形態(tài)，12個細(xì)胞亞系均源于單個細(xì)胞形成的完全克隆，均可進(jìn)行連續(xù)傳代與擴(kuò)增，而部分克隆與旁克隆則在后續(xù)培養(yǎng)中逐漸衰老與消亡。結(jié)論 Tca8113M1細(xì)胞系中可能存在癌干細(xì)胞，而單細(xì)胞培養(yǎng)可形成完全克隆并建立細(xì)胞亞系，是進(jìn)行舌癌干細(xì)胞后續(xù)研究重要的細(xì)胞培養(yǎng)模式。

[關(guān)鍵詞] 單細(xì)胞； 有限稀釋法； 舌癌干細(xì)胞； 完全克隆

[中圖分類號] Q 21 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干細(xì)胞是癌組織中一小群具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，具有自我復(fù)制與更新的能力，而且增殖與分裂能力極強(qiáng)，少量細(xì)胞即可形成體外移植瘤[1]。近年

有關(guān)腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥與復(fù)發(fā)等諸多難題均從癌干細(xì)胞的角度進(jìn)行研究。這種研究的基礎(chǔ)和前提是明確癌干細(xì)胞的標(biāo)志或分離出癌干細(xì)胞，以提供研究的靶細(xì)胞。目前已發(fā)現(xiàn)多種永生性癌細(xì)胞系中存在有癌干細(xì)胞，Tca8113M1舌癌細(xì)胞系同樣可能存在有癌干細(xì)胞，可以作為舌癌干細(xì)胞的研究對象。鑒于癌干細(xì)胞獨(dú)特的自我復(fù)制與更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌細(xì)胞系為研究對象，采用有限稀釋法分離出單個舌癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，利用癌干細(xì)胞的自我復(fù)制能力進(jìn)行分裂增殖，形成預(yù)期的單細(xì)胞克隆，進(jìn)一步形成細(xì)胞亞系，以此證明Tca8113M1

舌癌細(xì)胞系中存在癌干細(xì)胞的可能性，同時檢測細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)情況，觀察不同細(xì)胞亞系的生物學(xué)特性，并且動態(tài)觀察單細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞克隆形成的規(guī)律，為從Tca8113M1細(xì)胞系中分離舌癌干細(xì)胞提供前期實(shí)驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 舌癌細(xì)胞系來源

人舌癌細(xì)胞系Tca8113由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實(shí)驗室建系，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院贈送。右江民族醫(yī)學(xué)院腫瘤分子生物學(xué)實(shí)驗室在此基礎(chǔ)上建立了轉(zhuǎn)移人舌癌細(xì)胞系Tca8113M1[2]。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清（Hyclone公司，美國），RPMI1640培

養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；PE標(biāo)記抗人CD44抗體，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的抗人細(xì)胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-

gen，ESA）抗體，PE/cy5標(biāo)記抗人CD184抗體，同

型對照抗體分別為大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1與小鼠IgG2aκ4。CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國），倒置顯微鏡（Olympus公司，日

本）。

1.3 體外單細(xì)胞培養(yǎng)、建系及細(xì)胞克隆生長的動態(tài)

觀察

采用有限稀釋法進(jìn)行體外單細(xì)胞培養(yǎng)與建系。Tca8113M1細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至96孔板，采用有限稀釋法保證每個孔有1個細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察其生長和增殖情況，待其生長成多個細(xì)胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)移至6孔板擴(kuò)增培養(yǎng)后，在培養(yǎng)瓶中反復(fù)傳代建立細(xì)胞亞系。此外，在此培養(yǎng)過程中動態(tài)觀察單個細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)與生長情況，觀察時點(diǎn)分別為3 d和1、2、3周。

1.4 舌癌細(xì)胞亞系成瘤性檢測

建立裸鼠皮下移植瘤模型。體外培養(yǎng)Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系細(xì)胞，選取形態(tài)良好的生長期細(xì)胞，在生長旺盛時接種。具體步驟如下：消化收集舌癌細(xì)胞，800 r?min-1離心3～

5 min，棄上清液，計數(shù)細(xì)胞總量，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液按每毫升1×107個細(xì)胞的密度稀釋細(xì)胞；消毒裸鼠右腋窩的皮膚，將細(xì)胞接種于皮下，以皮下結(jié)節(jié)直徑超過1.0 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。共接種裸鼠45只，具體分組如下：1）Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系組，共12個亞系，每組3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌細(xì)胞組，6只，為母系細(xì)胞系對照組；3）Tca8113舌癌細(xì)胞組，3只，為來源細(xì)胞系對照組。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測舌癌細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)

志CD44、CD184、ESA的表達(dá)情況

將舌癌細(xì)胞（密度為每毫升1×106個）消化以后，800 r?min-1離心5 min，棄上清液，加入D-hanks液重懸，盡量將細(xì)胞吹散，將細(xì)胞懸液分別移入試管中（每管體積為500 μL），設(shè)置對照管和樣本管。在對照管中加入同型對照抗體（分別是大鼠IgG2bκ2、小鼠

IgG1與小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在樣本管中加入熒光抗體（PE標(biāo)記抗人CD44、FITC標(biāo)記抗人ESA、PE/cy5

標(biāo)記抗人CD184）各5 μL，置于避光環(huán)境下室溫孵育30 min，然后于流式細(xì)胞儀上檢測CD44、CD184、ESA的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 Tca8113M1細(xì)胞體外單細(xì)胞建系培養(yǎng)

Tca8113M1單細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞貼壁；24 h后部分細(xì)胞出現(xiàn)變大變薄、空泡樣變等老化現(xiàn)象；3 d后，有7個孔的細(xì)胞出現(xiàn)增殖分裂現(xiàn)象；7～10 d后有12個孔的細(xì)胞開始增殖為單個或數(shù)個完全細(xì)胞克隆（克隆形成過程見圖l）。

培養(yǎng)4～6周后，細(xì)胞基本達(dá)到穩(wěn)定生長并增殖的狀態(tài)，以癌細(xì)胞的克隆樣生長為主，細(xì)胞呈鋪路石狀，可見巨核、多核細(xì)胞，核分裂象多見。待培養(yǎng)孔接近80%鋪滿時，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板上擴(kuò)增培養(yǎng)，1～2周后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代30代后凍存。本研究以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單細(xì)胞，并在96孔板中進(jìn)行體外傳代建系培養(yǎng)，獲取12個細(xì)胞亞系，比例為6.25%，分別命名為Tca8113-S1～Tca8113-S12。

2.2 Tca8113M1細(xì)胞體外單細(xì)胞培養(yǎng)形成細(xì)胞克隆

的動態(tài)觀察

以3 d和1、2、3周為觀察時點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)單個細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)主要有3種：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12細(xì)胞亞系的細(xì)胞均源于單個細(xì)胞形成的完全克隆，均可以進(jìn)行連續(xù)傳代與細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，而其他單個細(xì)胞培養(yǎng)形成的部分克隆與旁克隆則在后續(xù)培養(yǎng)中逐漸衰老與消亡，未能連續(xù)傳代進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。3種克隆在培養(yǎng)過程中的變化情況如下。1）完全克?。杭?xì)胞之間緊湊密集成型，增殖速度快，其中1～2周為典型的完全克隆狀，3周時在細(xì)胞克隆中央出現(xiàn)細(xì)胞重疊生長現(xiàn)象（圖2中A1～A4）；2）部分克?。嚎寺⌒螒B(tài)界于旁克隆與完全克隆之間，細(xì)胞間較疏松，其中1～2周為典型的部分克隆狀，但第3周細(xì)胞克隆疏松，形狀消散，

有轉(zhuǎn)變?yōu)榕钥寺〉内厔荩▓D2中B1～B4）；3）旁克?。?/p>

細(xì)胞間疏松不成型，第1周較典型，第2、3周后細(xì)胞老化（圖2中C1～C4）。

2.3 Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系成瘤情況

將舌癌細(xì)胞亞系Tca8113-S1～Tca8113-S12接種于裸鼠皮下后，1周后可觸及皮下結(jié)節(jié)，表面光滑、質(zhì)硬、可活動；2周后可見皮下結(jié)節(jié)生長迅速；3～4周后皮下結(jié)節(jié)最大直徑達(dá)1.0 cm以上。含對照組在內(nèi)的45只裸鼠均接種成瘤，成瘤率為100%。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志

CD44、CD184、ESA表達(dá)情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6與Tca8113-S10的ESA陽性表達(dá)率分別為60.7%±3.6%、74.1%±1.5%與65.3%±2.8%外，其余細(xì)胞亞系ESA的陽性表達(dá)率均在80%以上；各亞系CD44陽性表達(dá)率均很高，除了Tca8113-S7為68.9%±2.4%外，其余亞系的陽性率均在90%以上；12個亞系的CD184表達(dá)存在差異，陽性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之間波動。

3 討論

本研究利用有限稀釋法等經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以舌癌Tca8113M1細(xì)胞系為研究對象，隨機(jī)選取192個舌癌細(xì)胞，在96孔板中進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過長期傳代培養(yǎng)，共建立12個舌癌Tca8113細(xì)胞亞系，比例為6.25%，而且都具備很強(qiáng)的成瘤性。進(jìn)一步檢測12個Tca8113細(xì)胞亞系的癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CD44與ESA均為高水平表達(dá)，陽性表達(dá)率多在90%左右，而CD184的陽性表達(dá)率則各有不同。據(jù)此結(jié)果可以結(jié)合癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性對本實(shí)驗獲得的細(xì)胞系進(jìn)行分析。

本研究發(fā)現(xiàn)：舌癌Tca8113M1細(xì)胞系中有6.25%的單個細(xì)胞可以進(jìn)行自我分裂、增殖，形成細(xì)胞亞系。還有研究[3]發(fā)現(xiàn)：Tca8113細(xì)胞連續(xù)經(jīng)過兩次單細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗，其中具備分裂增殖活性的細(xì)胞比例為5.09%～10.85%。這提示即使在永生化細(xì)胞系中，具備持續(xù)增殖能力的細(xì)胞占整個群體的比例都較少。根據(jù)目前的文獻(xiàn)[4]報道，在癌細(xì)胞群或組織中，癌干

細(xì)胞比例為0.01%～5%；體外培養(yǎng)的永生化癌干細(xì)胞系中，癌干細(xì)胞的比例可能偏高一些。本研究采用經(jīng)典的有限稀釋法獲取單個細(xì)胞，這種細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的增殖與分裂活力，而且還形成了成瘤性很強(qiáng)的細(xì)胞亞系。這些單個培養(yǎng)的細(xì)胞是否就是癌干細(xì)胞尚需進(jìn)行單細(xì)胞水平的鑒定，但可以大膽推測的是，其中應(yīng)該包含有癌干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞的概念于20世紀(jì)60年代提出，并據(jù)此建立了腫瘤細(xì)胞克隆實(shí)驗。本研究在單個細(xì)胞培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞的增殖方式是克隆樣增殖，即形成一個細(xì)胞克隆后擴(kuò)大生長，并且在周圍形成小的細(xì)胞克隆，最后融合成片，但究其細(xì)胞來源就是一個癌細(xì)胞而已，所有后續(xù)的細(xì)胞克隆與癌細(xì)胞就是源于它，所以可以認(rèn)為該細(xì)胞具有癌干細(xì)胞的潛質(zhì)，可以考慮從癌細(xì)胞系中篩選癌干細(xì)胞。

在12個Tca8113細(xì)胞亞系中，為明確其癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)情況，為后續(xù)舌癌干細(xì)胞的篩選提供前期實(shí)驗數(shù)據(jù)，本研究綜合文獻(xiàn)報道，選取了CD44、ESA與CD184等癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志進(jìn)行檢測。CD44是乳腺癌、頭頸部腫瘤、結(jié)腸癌等上皮組織的癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志，CD184是胰腺癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志；ESA則是上皮來源的癌干細(xì)胞標(biāo)志，而且屬于細(xì)胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12個細(xì)胞亞系中，

CD44與ESA均處于高水平表達(dá)，而CD184的表達(dá)則高低不一，其中亞系間均數(shù)差值最大者接近60%。從這3個指標(biāo)的表達(dá)情況來分析，可以進(jìn)行如下推測：1）CD44與ESA是不同細(xì)胞亞系共有的標(biāo)志，提示這些細(xì)胞亞系可能具有共同的組織起源；2）CD184的差異性表達(dá)提示Tca8113細(xì)胞系中存在細(xì)胞異質(zhì)性，但從其比例來看，大致有3個等級，即15%、30%、50%以上，提示其生物學(xué)特性可能有明顯的差別，但可作為舌癌干細(xì)胞研究的候選細(xì)胞群體進(jìn)行研究。

此外，在單個細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上建立細(xì)胞亞系的過程中，筆者發(fā)現(xiàn)單個細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)與細(xì)胞最后成系關(guān)系密切。在單個細(xì)胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3種克隆形式中，只有完全克隆能夠形成細(xì)胞亞系，而且這些細(xì)胞亞系表現(xiàn)出腫瘤的異質(zhì)性與成瘤性，而部分克隆以及旁克隆則在傳代與擴(kuò)增培養(yǎng)過程中逐漸老化或消亡。這一結(jié)果可進(jìn)行逆向推理：將最初形成完全克隆的12個細(xì)胞確定為舌癌干細(xì)胞，而其形成的完全克隆則是癌干細(xì)胞自我更新與增殖的結(jié)果，其中可能富含癌干細(xì)胞。這一觀點(diǎn)也為前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等相關(guān)研究[7-12]所證實(shí)。這些研究發(fā)現(xiàn)完全克隆細(xì)胞可以高表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)志；接種1 000個完全克隆前列腺癌細(xì)胞就可形成移植瘤；通過懸浮球培養(yǎng)的癌細(xì)胞球在消化后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，可以形成高比例的完全克隆。有學(xué)者[13]進(jìn)一步在頭頸腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，CD133與CD44陽性表達(dá)的癌細(xì)胞多形成完全克隆，而CD133與CD44陰性的癌細(xì)胞則多趨向于形成部分克隆或旁克隆，從而認(rèn)為CD133與CD44是頭頸腫瘤癌干細(xì)胞的標(biāo)志。由此可見，完全克隆為癌干細(xì)胞的自我更新方式與富集、純化癌

干細(xì)胞及癌干細(xì)胞標(biāo)志的研究提供了新的途徑，近年在癌干細(xì)胞研究中逐漸被應(yīng)用和關(guān)注[11]。此外，針對完全克隆的研究切入時間與方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在單個細(xì)胞培養(yǎng)1～2周時形成，最好不要超過3周；擴(kuò)增培養(yǎng)后，可使癌干細(xì)胞比例減少或分化細(xì)胞比例增加，從而影響對癌干細(xì)胞行為學(xué)的觀察。

本研究屬于尋找舌癌干細(xì)胞的前期性和階段性實(shí)驗，但是結(jié)果很有意義，這12個細(xì)胞亞系表明了Tca8113M1細(xì)胞系中有存在舌癌干細(xì)胞的可能性，而其最初的來源細(xì)胞系Tca8113也應(yīng)存在癌干細(xì)胞。結(jié)合細(xì)胞克隆形態(tài)分析的單個癌細(xì)胞培養(yǎng)模式可為深入研究舌癌干細(xì)胞提供細(xì)胞研究平臺。

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篇3

關(guān)鍵詞：天然氣；催化燃燒；細(xì)胞；培養(yǎng)

中圖分類號：F407文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

隨著我國大氣污染的日益嚴(yán)重，霧霾天氣區(qū)域性頻發(fā)，環(huán)境問題已變成當(dāng)前棘手的問題[1]。天然氣催化燃燒能從源頭上防治污染和保護(hù)生態(tài)環(huán)境，有助于形成低投入“低消耗”低排放和高效率的節(jié)約型增長方式，有利于對消耗高“污染重”技術(shù)落后的工藝和產(chǎn)品實(shí)施淘汰，降低污染物排放總量，加強(qiáng)資源綜合利用，加強(qiáng)污染防治[2]。

天然氣屬于清潔能源，天然氣催化燃燒能達(dá)到CO和NOx均小于5ppm的近零污染物排放，是一種節(jié)能環(huán)保的燃燒方式。天然氣燃燒溫度在1000℃以上，燃燒后的煙氣無菌潔凈[3-4]，對環(huán)境無污染，可將煙氣與空氣和CO2按照一定比例配比，配比后的氣體達(dá)到干細(xì)胞所需要的氣體成分，[5-7]，由于高溫?zé)煔馀c空氣和CO2混合的，所以混合后的氣體潔凈無菌[4]，可將其經(jīng)過過濾和降溫通入無菌箱或超凈工作臺使工作區(qū)域潔凈無菌，也可將氣體通入到CO2培養(yǎng)箱中，應(yīng)用到干細(xì)胞培養(yǎng)。

1.天然氣催化燃燒煙氣分析

中國計量科學(xué)研究院對天然氣催化燃燒煙氣檢測報告結(jié)果如表1所示：

表1 天然氣催化燃燒各組分氣體濃度

天然氣催化燃燒，燃料燃燒充分，并且其燃燒溫度在1100攝氏度左右，基本上全部轉(zhuǎn)為CO2和H2O，CO 和 NOx均小于5ppm，基本為零，由于天然氣中摻加極少量的H2S，燃燒產(chǎn)物為SO2和SO3，但其含量小于5ppm，幾乎為零，所以天然氣催化燃燒效率高，燃燒產(chǎn)物潔凈無菌，可將其用到無菌箱中。

2.干細(xì)胞培養(yǎng)所需氣體環(huán)境

除了滿足營養(yǎng)的需要以外，培養(yǎng)環(huán)境還必須具備細(xì)胞生存并繁殖的生理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性，包括溫度、氣相及PH等。

2.1溫度

體外培養(yǎng)的細(xì)胞需在保持一定恒溫的環(huán)境中才能生長，其適宜的溫度與取材的動物種類有關(guān)。

2.2氣相及pH

體外培養(yǎng)細(xì)胞需要理想的氣體環(huán)境。包括O2及CO2，但其量則須恰當(dāng)。多數(shù)細(xì)胞需要在有O2條件下才能生長，氧張力通常維持在略低于大氣狀態(tài)，若O2分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細(xì)胞有害。體外培養(yǎng)細(xì)胞采用開放培養(yǎng)時，其氣體環(huán)境一般應(yīng)為5%CO2＋95%空氣的混合氣體。大多數(shù)細(xì)胞適于在pH7.2~7.4條件下生長，低于pH6.8或高于pH7.6可能對細(xì)胞有害，甚至退變或死亡。

3.3 無污染及無毒

體外培養(yǎng)的細(xì)胞必須生長于無污染及無毒的環(huán)境。無毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件 [5]。

3. 催化燃燒煙氣在細(xì)胞培養(yǎng)上的應(yīng)用

無菌箱或超凈工作臺是細(xì)胞培養(yǎng)中要使用的，催化燃燒煙氣作為潔凈無毒無污染的煙氣可作為無菌氣體持續(xù)不斷地通入無菌箱，可使無菌箱持續(xù)保持無菌的狀態(tài)[4]，燃燒的煙氣與空氣、CO2按照一定比例混合后經(jīng)過過濾降溫通入無菌箱可以持續(xù)的保持無菌箱的無菌狀態(tài)，我們將在無菌箱中對細(xì)胞操作完之后，將處理后的細(xì)胞放入CO2培養(yǎng)箱，傳統(tǒng)形式下需要一個5%的CO2瓶專門向CO2箱通入所需氣體，現(xiàn)在我們只需要將通入無菌箱的氣體通入CO2培養(yǎng)箱即可。

4. 實(shí)驗裝置

天然氣催化燃燒V型爐煙氣分析系統(tǒng)如圖1所示，本次實(shí)驗采用了兩塊獨(dú)石并排的催化燃燒V型燃燒器，所用獨(dú)石為堇青石蜂窩陶瓷，獨(dú)石內(nèi)表面上鍍著鈀（Pd）和銠（Rh）催化劑，獨(dú)石采用正方形截面尺寸為150mm×150mm，厚度為20mm，獨(dú)石孔道尺寸1mm×1mm，壁厚0.18mm，軟化溫度為1380℃。

圖1. 天然氣催化燃燒V型爐系統(tǒng)圖

反應(yīng)氣體天然氣和空氣分別通過量程為0~50 L/min 型號為GMS005 0BSRN200000的流量計和量程為0~80m3/h 型號為CMG400A080100000的空氣流量計進(jìn)行調(diào)節(jié)，這兩個有穩(wěn)流穩(wěn)壓器提供電流。在催化燃燒器點(diǎn)火前需要對燃燒器內(nèi)部的混合腔利用風(fēng)機(jī)進(jìn)行吹掃5 分鐘左右，來保證內(nèi)部無殘留的燃?xì)?。點(diǎn)火過程中，先將過量空氣系數(shù)調(diào)整到1.3左右進(jìn)行氣相燃燒從而達(dá)到預(yù)熱的目的，期間觀察催化劑獨(dú)石表面待表面火焰基本消失且內(nèi)部變?yōu)榧t色時，將空氣量調(diào)大使過量空氣系數(shù)達(dá)到2.0左右，此狀態(tài)為催化燃燒的穩(wěn)定燃燒狀態(tài)。此時，通過煙氣分析儀測量排放的煙氣，NO-NO2-NOx分析儀測量煙氣含量，待數(shù)據(jù)穩(wěn)定后進(jìn)行記錄。在箱體出口處插入熱電偶測量煙氣溫度。

5. 實(shí)驗結(jié)果分析

5.1 實(shí)驗結(jié)果

我們做了四組實(shí)驗分別是燃?xì)饬髁繛?.1L/min 、7、8、9，相應(yīng)的空氣流量為7.3m3/h、7.8、9.2、10.3，對應(yīng)的空氣系數(shù)是2.09、1.94、2、2。圖2為記錄的煙氣成分CO、CO2、NOx濃度以及煙氣溫度。

圖2.不同燃?xì)饬髁肯聼煔飧鞒煞譂舛葓D 3.不同燃?xì)饬髁肯聼煔鉁囟?/p>

從圖2可以看出，NOx體積分?jǐn)?shù)都在1ppm以下，CO體積分?jǐn)?shù)在5ppm以下，接近于0，污染物含量極低，燃燒效果較好，CO2含量在5.7%上下，略高于細(xì)胞培養(yǎng)要求的5%，若將其應(yīng)用到細(xì)胞培養(yǎng)必須改變CO2含量。從圖3可以看出，排煙溫度在300℃以上，接近400℃，與細(xì)胞培養(yǎng)要求的37℃相差甚遠(yuǎn)，必須降溫。因此需要考慮將煙氣中通入某種氣體或者某幾種氣體將CO2和O2含量調(diào)節(jié)到細(xì)胞培養(yǎng)要求的含量。下面具體分析煙氣的主要成分。

5.2 天然氣組分說明

表 3-2 為通過氣相色譜儀所測得的實(shí)驗過程中所使用的天然氣組分及各組分的體積含量。

表1.天然氣各組分體積分?jǐn)?shù)

5.21由于天然氣的主要成分是甲烷，所以天然氣燃燒的化學(xué)反應(yīng)方程式如下[8]：

實(shí)驗用到的天然氣中甲烷占燃料總體積的 93%以上，所以實(shí)驗中是以甲烷的不完全燃燒情況進(jìn)行了計算。所有含碳燃料在燃燒過程中都會產(chǎn)生CO這一中間產(chǎn)物。根據(jù)上述反應(yīng)方程式可知，反應(yīng)前后C原子個數(shù)是守恒的，反應(yīng)后CO和CO2的總體積與反應(yīng)前CH4的體積相等，即 。因為含量微乎其微，可以忽略不計，所以可以認(rèn)為和燃燒前的含量相等，即；產(chǎn)生水蒸氣的量為，需要氧氣量，需要空氣量

煙氣總體積:

5.22 過量空氣系數(shù)為時，過量空氣相當(dāng)于多出未參加燃料反應(yīng)的那部分空氣產(chǎn)生的和水蒸氣的量不變，即，

過量空氣相當(dāng)于多出未參加燃料反應(yīng)的那部分空氣，煙氣中氧氣的體積:

煙氣的總體積：

干煙氣的總體積：

二氧化碳的體積分?jǐn)?shù):

氧氣的體積分?jǐn)?shù):

干煙氣中二氧化碳的體積分?jǐn)?shù):

氧氣的體積分?jǐn)?shù):

催化燃燒空氣的空氣系數(shù)是2，當(dāng)過量空氣系數(shù)為2時，帶入上式

二氧化碳體積分?jǐn)?shù)（煙氣中有水蒸氣）:

氧氣體積分?jǐn)?shù)（煙氣中有水蒸氣）:

二氧化碳體積分?jǐn)?shù)（煙氣中沒有水蒸氣）:

氧氣體積分?jǐn)?shù)（煙氣中沒有水蒸氣）:

5.23 煙氣分析儀使用塑料管將氣體通入分析儀分析煙氣成分，在管道中煙氣降溫到室溫，水蒸氣冷凝，所以可以近似認(rèn)為煙氣分析儀分析的氣體為干煙氣，數(shù)據(jù)計算CO2含量5.5%與實(shí)驗相當(dāng)接近。

由于需要將煙氣中通氣體，雖然向濕煙氣中通氣體調(diào)節(jié)，但通入細(xì)胞培養(yǎng)儀器時的溫度為37℃，中間水蒸氣還會冷凝，所以調(diào)節(jié)氣體的體積分?jǐn)?shù)時仍然需要按照干煙氣的計算調(diào)節(jié)。

對比煙氣成分含量與要求的成分含量可以看出，需要降低CO2含量，提高氧氣含量。因為氧氣提高到略低于21%所以可以通入空氣，即能提高O2含量又能降低CO2。假定煙氣總體積為V，通入空氣體積為Vx，則CO2體積為5.541，O2為11.082。

通過計算通入空氣后CO2含量會低于要求的含量，因此還需通入CO2，通入CO2體積為VY

將，，，

解得，

當(dāng)煙氣的體積為V（不含水蒸氣）時，通入的燃?xì)饬繛?.0554V，空氣量為1.0554V，所以只要通入體積，燃?xì)饬浚嚎諝饬浚篊O2量=0.0554:155；0.0523=1:2797:0.944時，輸出的煙氣的成分即為，。

6. 結(jié)論

天然氣屬于清潔能源，天然氣催化燃燒煙氣潔凈無菌，將燃燒廢氣收集重新利用通入CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)，此種方法使用即可以將煙氣充分利用，減少CO2排放，并且操作簡單，只需要向燃燒完的高溫?zé)煔庵型ㄈ攵康目諝夂虲O2即可，而且從通入氣體的比例來看，生成需要的氣體向煙氣中通入的空氣很多，通入的CO2確很少，比較經(jīng)濟(jì)，因此天然氣催化燃燒煙氣應(yīng)用到細(xì)胞培養(yǎng)是種經(jīng)濟(jì)環(huán)保的方式。

致謝

本資金由北京市供熱供燃?xì)馔L(fēng)及空調(diào)工程重點(diǎn)實(shí)驗室提供，項目編號cxy2012019。

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篇4

關(guān)鍵詞：高職教育;工學(xué)結(jié)合;細(xì)胞培養(yǎng);課程開發(fā)

中圖分類號：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）05-0044-02

一、工學(xué)結(jié)合的定義

工學(xué)結(jié)合是一種學(xué)習(xí)和工作相結(jié)合的人才培養(yǎng)模式，是將理論與實(shí)踐相結(jié)合，從而提高課堂教學(xué)效果的一種教學(xué)模式。2001年4月由東北大學(xué)主持召開的“美國合作教育大會”指出，工學(xué)結(jié)合是將理論知識和職業(yè)技能以及工作實(shí)踐結(jié)合在一起，是使學(xué)生提高就業(yè)率的一種有效的教學(xué)方法。

二、工學(xué)結(jié)合培養(yǎng)模式的開發(fā)背景及現(xiàn)狀

工學(xué)結(jié)合人才培養(yǎng)模式的主要功能是提高學(xué)生綜合素質(zhì)和就業(yè)競爭力。這種模式涉及面很廣，牽涉到了社會、教育、產(chǎn)業(yè)等多個方面，從而需要獲得社會、教育和政府等多個方面的配合和支持。在教育教學(xué)方面，工學(xué)結(jié)合的模式需要建立對應(yīng)的教學(xué)制度和管理體制，多個部門相配合，同時還是要聘請一些大企業(yè)的優(yōu)秀工程師做相應(yīng)的講解等活動，以增加學(xué)生的社會實(shí)踐經(jīng)。

在產(chǎn)業(yè)方面，學(xué)生去企業(yè)單位實(shí)踐需要滿足三個要求：一是雇傭?qū)嵙?xí)生需要付出的費(fèi)用較低。企事業(yè)單位的部分崗位技術(shù)要求和風(fēng)險較低，用成熟的老手費(fèi)用高，因此才會考慮剛畢業(yè)的技術(shù)不成型的學(xué)生;二是國家政策的需求。國家支持鼓勵企事業(yè)單位吸納實(shí)習(xí)學(xué)生，同時還推出稅收優(yōu)惠的政策，從而使更多的單位樂于接受實(shí)習(xí)生;三是著眼于長遠(yuǎn)之計，企事業(yè)單位由于每年的人流量很大，雇傭?qū)嵙?xí)生也能夠為企業(yè)儲備后繼力量。

從政府方面來說，很多發(fā)達(dá)國家都制定了相關(guān)政策。一是支持鼓勵企業(yè)單位雇傭?qū)嵙?xí)生;二是鼓勵學(xué)校更多的運(yùn)用工學(xué)結(jié)合教學(xué)模式。而我國由于開展工學(xué)結(jié)合模式較晚，所以各個方面的條件還不是很完善，尤其在產(chǎn)業(yè)和政策方面，國家處于發(fā)展的階段，一些政策還不能滿足用人單位的雇傭條件，不能夠讓單位和學(xué)生產(chǎn)生較高的積極性。在教育教學(xué)方面，政府沒有鼓勵學(xué)校實(shí)施工學(xué)結(jié)合人才培養(yǎng)模式的專項經(jīng)費(fèi)投入，造成因條件不健全學(xué)校實(shí)施工學(xué)結(jié)合人才培養(yǎng)模式困難重重：首先，多數(shù)學(xué)校都沒有建立專業(yè)的管理部門，管理上比較薄弱。由于教學(xué)管理部門的功能設(shè)定和主要服務(wù)對象是校內(nèi)，因此很難勝任大量的對外聯(lián)系和過程管理。其次，在人員結(jié)構(gòu)方面，由于沒有專門的管理機(jī)構(gòu)，缺乏真正意義上的“雙師結(jié)構(gòu)”隊伍。高職院校大部分教師缺乏生產(chǎn)實(shí)踐鍛煉，受傳統(tǒng)普通高等教育的影響，課程體系和教學(xué)內(nèi)容設(shè)計過分強(qiáng)調(diào)理論的系統(tǒng)性。第三，在教學(xué)制度方面，我們尚沒有成熟的“完全學(xué)分制”和“彈性學(xué)制”，學(xué)生的自主選擇受到一定的限制。第四，在課程方面，我們還是從教學(xué)而不是從育人的角度看待課程。第五，在社會層面，國人也還停留在重知識、輕技能的傳統(tǒng)思想里，希望孩子通過讀書改變自身現(xiàn)狀，家長更愿意看到孩子在校讀書，而不是進(jìn)入企業(yè)工作。

三、細(xì)胞培養(yǎng)課程的開發(fā)思路

由于政府、產(chǎn)業(yè)、教育和社會等各方支持系統(tǒng)要素的短缺，現(xiàn)有國情限制了學(xué)生大規(guī)模、有序地進(jìn)入企業(yè)工作、學(xué)習(xí)，我國高等職業(yè)院校的教育與企業(yè)生產(chǎn)實(shí)際需求脫節(jié)，已經(jīng)造成了目前勞動力市場上高等職業(yè)教育培養(yǎng)的畢業(yè)生與企業(yè)需求供求失衡的現(xiàn)象，只能摸索適合中國國情的工學(xué)結(jié)合人才培養(yǎng)模式。這種情況下，教師可以通過社會調(diào)研，掌握相關(guān)企業(yè)及研發(fā)機(jī)構(gòu)的職業(yè)領(lǐng)域、崗位知識、崗位技能及職業(yè)素養(yǎng)等。

《細(xì)胞培養(yǎng)》是生物制藥技術(shù)專業(yè)的重要課程，課程目標(biāo)是培養(yǎng)能夠從事細(xì)胞分離制備、純化及檢驗的專業(yè)人員。通過企業(yè)調(diào)研，將崗位工作任務(wù)進(jìn)行能力分析，設(shè)置學(xué)習(xí)項目，通過一個個子任務(wù)來強(qiáng)化學(xué)生技能，循序漸進(jìn)安排教學(xué)過程。引導(dǎo)學(xué)生熟悉細(xì)胞培養(yǎng)所需要的無菌空間、常見設(shè)備及操作規(guī)范、細(xì)胞分離、純化、檢驗及凍存方法，提升學(xué)生職業(yè)操作能力，提高職業(yè)素養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)實(shí)踐教學(xué)與企業(yè)崗位需求的對接。

四、細(xì)胞培養(yǎng)課程內(nèi)容的開發(fā)及設(shè)計

《細(xì)胞培養(yǎng)》是在充分進(jìn)行崗位調(diào)研的基礎(chǔ)上設(shè)立的。課程內(nèi)容是以符合實(shí)際崗位能力需要的工作任務(wù)為載體，以工作過程為導(dǎo)向，結(jié)合學(xué)生的認(rèn)知規(guī)律和實(shí)際教學(xué)需求進(jìn)行設(shè)計，包含無菌操作空間設(shè)計和儀器設(shè)備操作維護(hù)、實(shí)驗前準(zhǔn)備、動物細(xì)胞的制備、細(xì)胞的分離純化、鑒定和保藏等，共9個項目、24工作任務(wù)及相關(guān)職業(yè)能力培養(yǎng)，突出實(shí)踐課程的重要性，注重學(xué)生技能操作和職業(yè)素質(zhì)培養(yǎng)，基本涵蓋生物制藥企業(yè)和科研院所細(xì)胞培養(yǎng)崗位所必須具有的制備、培養(yǎng)、分析鑒定所需的全部方法和技術(shù)。

五、有效課程評價體系的開發(fā)與設(shè)計

為了檢驗學(xué)生是否具備從業(yè)崗位所需的綜合職業(yè)能力和素質(zhì)，保證課程內(nèi)容能夠有效實(shí)施，我們建立了《細(xì)胞培養(yǎng)》課程評價體系，采用項目過程考評（任務(wù)考評）的方法，課程總成績=項目過程考評成績（70%）+理論應(yīng)知考試成績（30%），項目課程考評成績=素質(zhì)考評成績（25%）+實(shí)操考核成績（75%）。具體分類見表2。

六、教學(xué)實(shí)施中的有關(guān)問題分析

工學(xué)結(jié)合開發(fā)《細(xì)胞培養(yǎng)》課程是針對高職院校設(shè)計的，考慮到高職學(xué)生的特點(diǎn)，在教學(xué)實(shí)施中有以下幾個問題需要注意：

1.為了不污染無菌環(huán)境，無菌空間應(yīng)該避免一次性進(jìn)入過多學(xué)生。學(xué)教師帶領(lǐng)分組學(xué)生在無菌間實(shí)操時，無菌間外學(xué)生的安全衛(wèi)生及紀(jì)律問題需要設(shè)計周全。

2.受學(xué)時限制，任務(wù)以團(tuán)隊形式完成，少數(shù)學(xué)生會完全依賴團(tuán)隊“主力”，參與程度不夠。項目實(shí)施過程過中必須細(xì)化任務(wù)，確保每個學(xué)生都參與了項目的實(shí)施。

3.本課程是理論教學(xué)和學(xué)生實(shí)踐交叉進(jìn)行，理論是根據(jù)實(shí)踐任務(wù)所需的知識構(gòu)建，不同任務(wù)之間構(gòu)建的學(xué)習(xí)領(lǐng)域以細(xì)胞制備工作流程排序。

參考文獻(xiàn)：

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【關(guān)鍵詞】羊水細(xì)胞培養(yǎng)；染色體制備；方法

文章編號：1009-5519（2008）15-2221-02 中圖分類號：R71 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

羊水細(xì)胞培養(yǎng)及其染色體制備技術(shù)是胎兒染色體病產(chǎn)前診斷的重要手段。由于羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要求高、羊水中活細(xì)胞少、培養(yǎng)周期長、易污染、分裂相少；細(xì)胞收獲、低滲、固定、顯帶、染色諸多環(huán)節(jié)，相對于外周血染色體的制備，羊水細(xì)胞染色體制備的難度較大，任一環(huán)節(jié)不合適都可能導(dǎo)致失敗。針對上述情況，借鑒國內(nèi)外的一些經(jīng)驗[1~5]，我們摸索出了一種簡便、易行，提高羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備成功率的方法，收到良好效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料：（1）標(biāo)本來源：選擇來我院遺傳門診咨詢的15~29孕周，年齡25~45歲疑有染色體病胎兒的孕婦50例，其中產(chǎn)前篩查后，風(fēng)險率大于1/270的40例，年齡大于35歲的孕婦10例。（2）培養(yǎng)器皿：CO2培養(yǎng)箱，純度99.99%的CO2，25 ml培養(yǎng)瓶（CORNING，型號：3289），離心機(jī)，倒置顯微鏡等。（3）試劑：羊水培養(yǎng)基購自浙江貝因美公司。20 ?滋g/ml的秋水仙素，1%的檸檬酸三鈉，0.075 mmol/L的KCl，0.25%的胰蛋白酶，固定液由甲醇與冰醋酸按3∶1比例配成。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：囑孕婦平臥在手術(shù)床上，讓其左右翻身10次左右，以使羊膜腔內(nèi)脫落的細(xì)胞懸浮，在B超引導(dǎo)下，用7號穿刺針經(jīng)腹抽取羊水，先用5 ml注射器抽出2 ml羊水丟棄，再換用20 ml注射器抽取羊水20 ml，并迅速送到無菌間。

1.2.2 羊水細(xì)胞培養(yǎng)：（1）細(xì)胞收集：在生物安全柜內(nèi)，將羊水注入2只15 ml無菌離心管中，每只10 ml，1 000轉(zhuǎn)/分，10分鐘，棄上清，留0.5 ml，用無菌吸管輕輕吹打混勻。（2）接種：將混勻的羊水細(xì)胞接種于2個25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5 ml羊水培養(yǎng)液，輕輕混勻。（3）培養(yǎng)：酒精燈過火瓶口，擰緊瓶蓋臥式靜置于CO2培養(yǎng)箱中，溫度37 ℃，CO2濃度5%，培養(yǎng)6~7天后觀察細(xì)胞貼壁及生長情況。（4）細(xì)胞培養(yǎng)情況觀察：細(xì)胞培養(yǎng)6~7天后方可在倒置顯微鏡下觀察。此時，可見瓶底貼壁細(xì)胞已形成6~10個克隆，可換液。無菌操作將瓶內(nèi)液體收集于1個15 ml無菌離心管，重新加入4 ml羊水培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1~2天，鏡下可見較多大而亮圓的分裂期細(xì)胞，可終止培養(yǎng)進(jìn)行收獲。換液時換下的培養(yǎng)液可重新離心后將細(xì)胞接種于一個25 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)6~8天后仍會有新的細(xì)胞貼壁，并形成克隆，能有效防止第一次羊水細(xì)胞收集及染色體制備失敗。（5）終止培養(yǎng)：每瓶加秋水仙素（20 ?滋g/ml）40 ?滋l，旋緊瓶蓋37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1小時。

1.2.3 羊水細(xì)胞收獲：將羊水細(xì)胞培養(yǎng)液倒入一個干凈離心管中，用吸管吸干凈，快速將37 ℃溫?。?0分鐘以上）的0.25%的胰蛋白酶和1%的檸檬酸三鈉1∶9混合液1 ml加入培養(yǎng)瓶中，輕搖培養(yǎng)瓶，使消化液與培養(yǎng)瓶底面充分接觸，立即放回37 ℃培養(yǎng)箱中溫浴0.5~1分鐘，取出培養(yǎng)瓶，將上述離心管中的培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)瓶中，輕搖培養(yǎng)瓶，終止胰蛋白酶的消化作用，用細(xì)胞刮片輕輕刮下細(xì)胞。用吸管將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清，保留細(xì)胞沉淀。

1.2.4 低滲：加入37 ℃預(yù)溫30分鐘以上的0.075M KCl低滲液7 ml，用吸管輕輕吹勻細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮于低滲液中，放回37 ℃溫浴箱中，靜止30分鐘。

1.2.5 預(yù)固定：沿管壁緩慢加新鮮固定液（冰醋酸∶甲醇=3∶1）1.5 ml，用氣泡輕輕吹打溶液使其混勻；1 000轉(zhuǎn)/分，10分鐘。然后吸棄上清液，保留沉淀。

1.2.6 固定：沿離心管壁加入新鮮固定液5.5 ml，用氣泡吹勻，繼續(xù)固定30分鐘。1 000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。棄上清液，保留沉淀。

1.2.7 再固定：再加入新鮮固定液5.5 ml，用氣泡吹勻，靜止30分鐘。1 000轉(zhuǎn)/分，10分鐘。棄上清，保留沉淀。

1.2.8 3次固定：加入新鮮固定液0.5 ml制成細(xì)胞懸液。

1.2.9 滴片、烤片和顯帶：用滴管吸細(xì)胞懸液2~3滴，滴在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上，立即用口吹散，并在酒精燈的火焰下過火幾次，置75~80 ℃烤箱中烤片2小時。用預(yù)溫15分鐘的0.01%的胰蛋白酶消化25~30秒，Giemsa染色液染色10分鐘。

2 結(jié)果

2.1 羊水細(xì)胞生長情況：實(shí)驗結(jié)果顯示，50例孕婦羊水細(xì)胞培養(yǎng)均獲得成功，成功率100%，其中2例血性羊水細(xì)胞培養(yǎng)也獲得成功。

2.2 羊水細(xì)胞收集及染色體制備：實(shí)驗結(jié)果顯示，50例孕婦羊水細(xì)胞培養(yǎng)通過細(xì)胞收集及染色體制備，有49例獲得滿意的染色體分裂相，成功率98%，見圖1和圖2。

3 討論

羊膜腔穿刺技術(shù)具有一定的創(chuàng)傷性，一旦失敗孕婦難以接受再次穿刺。在實(shí)際工作中，影響羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備成功率的因素很多[6，7]。實(shí)驗結(jié)果顯示，雖然50例羊水細(xì)胞培養(yǎng)均獲得成功，但在細(xì)胞收獲、制片、消化、顯帶等環(huán)節(jié)上有1例出現(xiàn)問題，導(dǎo)致結(jié)果分析失敗。說明羊水細(xì)胞培養(yǎng)在加秋水仙素的時機(jī)、細(xì)胞收獲、低滲、固定、顯帶、染色等環(huán)節(jié)，也非常重要。在實(shí)驗中對以下環(huán)節(jié)進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，取得了滿意效果。

3.1 羊水細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境

3.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)瓶：使用CORNING 3289型細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞易于貼壁，快速生長。

3.1.2 在實(shí)驗中，使用純度為99.999%的高純CO2，細(xì)胞生長旺盛、舒展，在培養(yǎng)至第七天時，形成多個克隆。我們認(rèn)為高純度的CO2有利于羊水細(xì)胞的生長。

3.1.3 收獲時機(jī)的掌握非常關(guān)鍵：我們在換液后第二天，低倍鏡下見到5~10個細(xì)胞克隆，克隆中央基本無細(xì)胞老化，且細(xì)胞大而亮圓，有比較多的雙核細(xì)胞，即進(jìn)行收獲。我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時間越長，細(xì)胞越易老化，不宜收到較多的分裂中期的細(xì)胞。并不是細(xì)胞生長的時間越長、細(xì)胞越多獲得的中期細(xì)胞就越多。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞老化的太多，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3.1.4 秋水仙素的濃度：加秋水仙素的終濃度為0.20 ?滋g/ml，置37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1小時，獲得的染色體長短適中，易于分析。

3.1.5 收獲時消化液的選擇：采用1%的檸檬酸三鈉于0.25%的胰蛋白酶1∶9混合。消化時間短，僅需1~2分鐘即可。檸檬酸三鈉能使細(xì)胞連接松散，易于吹打成單個細(xì)胞，易于進(jìn)行低滲。

3.1.6 滴片：用滴管吸細(xì)胞懸液2滴，滴在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上，立即用口吹散，使細(xì)胞平鋪于載玻片上，并在酒精燈的火焰下通過幾次。載玻片過火可使染色體散開，便于找到好的染色體分裂相。

參考文獻(xiàn)：

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[6] 許爭峰，胡婭莉，朱瑞芳.高效羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2006，41(4)：275.

篇6

支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見、不易被察覺和干擾實(shí)驗結(jié)果的污染物，約有30.3％～50.5％的細(xì)胞培養(yǎng)物中有支原體污染。培養(yǎng)細(xì)胞中支原體污染的來源包括：所使用的動物來源的一些產(chǎn)品如血清或已被支原體污染的細(xì)胞株系。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中支原體的濃度可達(dá)107個/ml，而培養(yǎng)的細(xì)胞看起來很正常，在肉眼觀察或普通光學(xué)顯微鏡下觀察，受污染的細(xì)胞可無明顯變化。由于競爭營養(yǎng)及支原體有毒的代謝產(chǎn)物，支原體污染可顯著影響培養(yǎng)細(xì)胞的生理活性，使研究結(jié)果的真實(shí)性和可靠性大大下降。本實(shí)驗擬使用4種方案處理體外培養(yǎng)的支原體污染貼壁細(xì)胞，并就其療效進(jìn)行比較，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1．1 試劑及動物：(高糖)DMEM培養(yǎng)基：Giboco；胰蛋白酶：Gi-boco；DNA熒光法染色檢測支原體試劑盒：Epitomics；BM-Cy-din：Roche；Bab/c裸鼠：北京動物所。

1．2 細(xì)胞的來源和培養(yǎng)：人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心分子遺傳學(xué)研究室。體外于不加抗生素的內(nèi)含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

實(shí)驗分為試驗組、陽性對照組和陰性對照組。試驗組為支原體污染且用不同方法作用的細(xì)胞，陽性對照組為支原體污染常規(guī)培養(yǎng)未作特殊處理的細(xì)胞，陰性對照組為常規(guī)培養(yǎng)支原體未污染的正常細(xì)胞。

2．1 支原體污染檢測：被檢細(xì)胞接種在無菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為2×10O4/ml。5天后，先吸去培養(yǎng)液，再加入1ml的固定液，靜置20min，吸去固定液，風(fēng)干10min。于每孔中，加入lml的Hoechst33258工作液，37℃，20min。吸去Hoechst 33258工作液，風(fēng)干后加入1滴封固液，并以蓋玻片覆蓋。用400x熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

2．2 支原體污染清除：試驗組細(xì)胞按5×104/ml密度接種于25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)。利用各種方法作用后，檢測支原體污染情況。陰性對照組及陽性對照組用不加抗生素的含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．2．1 加溫法：試驗組細(xì)胞放入41℃溫箱內(nèi)，分別在8h、12h、16h、24h及48h末進(jìn)行支原體的檢測。

2．2．2 多西環(huán)素、環(huán)丙沙星聯(lián)合排除法：多西環(huán)素和環(huán)丙沙星聯(lián)合用藥，試驗組分為3組，兩種藥物用量分別為30μg/ml，50μg/ml和100μg/ml，培養(yǎng)24h、36h、48h末進(jìn)行支原體的檢測。

2．2．3 BM-Cyclin-1、2排除法：細(xì)胞傳代同時加BM-Cychn-l10μg/ml，37℃培養(yǎng)3天；胰蛋白酶消化、傳代，加入BM-Cyclin-25μg/ml，37℃培養(yǎng)3天；繼續(xù)傳代追加BM-Cychn-2 5μg/ml次，培養(yǎng)2～4天棄藥液，D-Hank's液洗2次，胰蛋白酶消化傳代，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

2．2．4 裸鼠過繼法去除支原體闖：將支原體污染的細(xì)胞用0，25％胰酶，0.02％EDTA消化制成單細(xì)胞懸液后用PBS洗滌離心2次，調(diào)細(xì)胞密度至107個/ml；經(jīng)小鼠背部皮下接種0.2ml細(xì)胞約10～15天后即可形成移植瘤；3～4周后無菌條件下取出移植瘤組織，剔除壞死部分，用注射器針芯在200目篩下將組織壓碎使細(xì)胞釋放人含0.1％EDTA的無血清DMEM培養(yǎng)液中：將細(xì)胞懸液小心加入含有淋巴細(xì)胞分離液離心管上層，室溫下水平離心3000r/min，20min；用吸管吸出兩種液體界面層的細(xì)胞置無血清DMEM培養(yǎng)液中，計數(shù)細(xì)胞；于無血清DMEM將細(xì)胞洗滌離心1次，用完全培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度至5×105個/ml，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3 結(jié)果

3．1 陰性對照組和陽性對照組：陰性對照組細(xì)胞經(jīng)Hoechst33258熒光染色后，僅細(xì)胞核顯色，細(xì)胞表面及細(xì)胞周圍干凈、清晰，無熒光小點(diǎn)。陽性對照組經(jīng)Hoechst33258熒光染色后，可見細(xì)胞核與細(xì)胞膜及其周圍均可見散在的藍(lán)色熒光顆粒，其密集程度與污染呈正相關(guān)。

3．2 加溫對支原體污染的治療效果：經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，加溫8h后，熒光小點(diǎn)開始變少。16h細(xì)胞周圍支原體幾乎消失。進(jìn)入24h開始細(xì)胞周圍的熒光小點(diǎn)完全消失，但細(xì)胞開始逐漸變圓。脫落飛48h大部分細(xì)胞已完全變圓，細(xì)胞正常形態(tài)消失，培養(yǎng)基中出現(xiàn)飄浮死亡細(xì)胞。

3．3 多西環(huán)素、環(huán)丙沙星聯(lián)合治療支原體的效果：30μg/ml組和50μg/ml組多西環(huán)素和環(huán)丙沙星作用細(xì)胞24h開始，熒光開始減少，36h僅見少量熒光，48h熒光完全消失。細(xì)胞未見明顯變形脫落、死亡。100μg/ml組的多西環(huán)素和環(huán)丙沙星聯(lián)合作用24h熒光完全消失，至36h細(xì)胞無明顯變形死亡，但48h開始出現(xiàn)細(xì)胞變圓，脫落，生長變慢。

3．4 BM-Cyclin-1、2排除法：按以上方法處理后，經(jīng)Hoechst33258熒光染色后，細(xì)胞表面及細(xì)胞周圍干凈清晰，無熒光小點(diǎn)。細(xì)胞無明顯脫落、變形死亡。

3．5 裸鼠過繼法處理細(xì)胞后常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng)Hoechst33258熒光染色后，未見支原體感染。細(xì)胞分裂生長旺盛。

4 討論

支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，大小一般在0.3～0.5μm之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。支原體約有1％可通過濾菌器，用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性，因此在普通光學(xué)顯微鏡下不易被發(fā)現(xiàn)。在電子顯微鏡下可見支原體多吸附或散在于細(xì)胞之間，斷面與細(xì)胞徽絨毛相似。支原體感染發(fā)生后能改變細(xì)胞的DNA、RNA及蛋白表達(dá)，對細(xì)胞的生理活動產(chǎn)生多方面的影響。由于支原體無細(xì)胞壁，所以通常作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感；對多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。本試驗用4種方法對支原體污染的體外培養(yǎng)貼壁細(xì)胞MCF-7進(jìn)行救治，現(xiàn)就其療效進(jìn)行比較。見表1。

篇7

撫順市疾病預(yù)防控制中心，遼寧撫順113006

[摘要] 目的 比較實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法與細(xì)胞培養(yǎng)法檢測流行性感冒病毒的差異。方法 采用實(shí)時熒光定量RT-PCR及經(jīng)典的狗腎傳代細(xì)胞病毒分離2種方法，同時對流感監(jiān)測點(diǎn)送檢的80份疑似流感標(biāo)本檢測流感病毒。 結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離的陽性數(shù)為26份，實(shí)時熒光定量RT-PCR的陽性數(shù)為36份，χ2=8.1， P<0.005。 結(jié)論 通過該實(shí)驗，驗證了實(shí)時熒光定量RT-PCR的確快速敏感，適用于實(shí)驗室快速診斷。

關(guān)鍵詞 實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；細(xì)胞培養(yǎng)法；流感病毒

[中圖分類號] R4[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1674-0742（2015）03（b）－0192-02

[作者簡介] 姜紅濤（1965-），女，天津人，本科，主管檢驗師，主要從事病毒檢驗工作。

2013年出現(xiàn)的流感病毒H7N9經(jīng)自然重配，致病迅速，易變異，給人們帶來極度恐慌，引起WHO 的高度重視[1]，從而使流感病毒病原學(xué)的準(zhǔn)確快速診斷顯得尤為重要。該實(shí)驗室在2014年1月采用整群抽樣法對撫順市流感監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院的80份疑似流感樣標(biāo)本進(jìn)行了實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法與細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行了檢測流行性感冒病毒的方法比較，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

2014年1月在撫順市國家級流感監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院，每周采集內(nèi)科和兒科門診就診的流感樣病例（體溫≥38℃，同時伴有咳嗽或者咽喉疼痛等癥狀的急性呼吸道感染者）的咽拭子標(biāo)本，放人pH 7．4-7．6的DMEM采樣液中，當(dāng)日低溫送流感實(shí)驗室檢測，每周采集 20份流感樣病例的咽拭子標(biāo)本。

1.2主要試劑

①抗A（H1N1）亞型血清，抗A（H3N2）亞型血清，抗A（H3N2）亞型血清，抗A（SWL1）亞型血清，抗B型Yamagata系病毒血清，抗B型Victoria系病毒血清由國家流感中心提供。MDCK細(xì)胞，遼寧省疾控中心提供；胰酶、Hank’液、胎牛血清﹑牛血清白蛋白組分V， 采購于BI公司。DMEM培養(yǎng)基，采購于GIBCO公司。

②提取RNA試劑盒為QIAGEN。

1.3主要儀器

AB PCR儀；二氧化碳培養(yǎng)箱 ；倒置顯微鏡等。

1.4實(shí)驗方法

1.4.1采用細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒，細(xì)胞為狗腎傳代細(xì)胞（MDCK）每份標(biāo)本接種細(xì)胞瓶2瓶，置34.5℃吸附1 h，倒掉感染液，再用Hank’s液洗2遍，加入病毒維持液，置34.5 ℃培養(yǎng)，每天觀察病理變化（CPU），當(dāng)CPU出現(xiàn)3～4個加號時，按常規(guī)法檢查維持液中的紅細(xì)胞凝集活性。將HA≥1：16的標(biāo)本采用血凝抑制方法（HI）進(jìn)行流感病毒型別鑒定[2]。確定病毒的型別和亞型。并送國家流感中心做進(jìn)一步鑒定。HA≤1：16的標(biāo)本未做分型鑒定。

1.4.2RT-PCR反應(yīng)體系的配置[3-4]反應(yīng)條件：60℃ 5min 50℃ 30min 95℃ 15min95℃ 15s，55℃退火30 s（收集熒光），72℃延伸 30s 45 cycle 72℃ 5min4℃ 保存。見表1。

1.5統(tǒng)計方法

配對設(shè)計的χ2檢驗，公式：χ2=（|b-c|-1）2/b+c v=1，P<0.005差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩種方法對80份咽拭液檢測流行性感冒病毒的結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒26株，陽性百分率32.50%，RT-PCR檢出36株，陽性百分率45.00%，見表2。

2.2兩種檢驗方法統(tǒng)計結(jié)果比較

細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒36株，陽性26株，RT-PCR檢出36株，兩種檢驗方法統(tǒng)計結(jié)果為χ2=8.1，因為χ20.005，1=7.88，所以P<0.005，兩種檢驗方法敏感性差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

2.3兩種方法對80份咽拭液檢測流行性感冒病毒的分型結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒H1N1（22份），H3N2（4份），熒光定量RT-PCR分離病毒H1N1（31份），H3N2（4份），By（1份）。

3討論

流感病毒病原學(xué)相關(guān)檢測目前常用的有病毒分離培養(yǎng)法、快速檢測、分子生物學(xué)方法等。病毒分離是診斷流感病毒的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，但耗時長是其缺點(diǎn)。而且宿主細(xì)胞生長狀態(tài)也是影響病毒生長及復(fù)制的關(guān)鍵因素[6]，導(dǎo)致疑似流感樣標(biāo)本到實(shí)驗室后，培養(yǎng)完成時間不確定。同時培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)的持續(xù)消耗以及宿主細(xì)胞的逐漸死亡是導(dǎo)致病毒滴度降低的直接原因[7]，收獲的病毒滴度高低存在著很多的不確定因素。而且，標(biāo)本采集后的保存運(yùn)送等環(huán)節(jié)都對MDCK培養(yǎng)分離流感病毒存在較大的影響。而實(shí)時熒光定量RT-PCR法應(yīng)用于流感病毒實(shí)驗室診斷，國內(nèi)外早已有許多報導(dǎo)[8]，它具有靈敏度高、特異性好、檢測所需時間短等等優(yōu)點(diǎn)，尤其在應(yīng)急疫情快速診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。它與經(jīng)典的MDCK細(xì)胞分離法相比，檢測時間可縮短到1 d之內(nèi)。由于在封閉管中進(jìn)行，省略了電泳這一步驟，減少了以往PCR技術(shù)導(dǎo)致的假陽性可能[8]。

該實(shí)驗室對2014年1月流感監(jiān)測點(diǎn)送檢的80份標(biāo)本，采用細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)時熒光定量RT-PCR 兩種方法檢測，同時進(jìn)行比較， 結(jié)果證實(shí)，實(shí)時熒光定量RT-PCR法對流行性感冒病毒的檢出率為45.00%，高于細(xì)胞培養(yǎng)法的病毒檢出率32.50%。實(shí)時熒光定量RT-PCR法和細(xì)胞培養(yǎng)法兩種檢驗方法χ2檢驗結(jié)果為χ2=8.1，P<0.005。對流感病毒的檢出敏感性差異顯著，對流感病毒的分型也是準(zhǔn)確無誤，在病毒含量較低的標(biāo)本中不存在漏檢情況發(fā)生。通過這兩種方法的比較，與浙江省疾病預(yù)防控制中心通過比較得出的，實(shí)時熒光定量RT-PCR法對大量疑似標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗室快速鑒別診斷，實(shí)用性強(qiáng)，快速敏感[9]的結(jié)論一致。驗證了實(shí)時熒光定量RT-PCR法確實(shí)是實(shí)驗室快速診斷流行性感冒病毒的首選方法，用實(shí)時熒光定量RT-PCR法檢測為流感病毒陽性的標(biāo)本接種MDCK細(xì)胞，培養(yǎng)分離流感病毒，可以降低細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒的成本，減少不必要的試劑材料的消耗，提高檢測效率。這僅僅是本實(shí)驗室的驗證結(jié)論，還需要其它研究中心加以驗證。

參考文獻(xiàn)

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篇8

【關(guān)鍵詞】 灌注培養(yǎng)；微載體；細(xì)胞截留

隨著單克隆抗體藥物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，帶動了大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷提高。利用動物細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體已成為當(dāng)前生物制藥企業(yè)的發(fā)展方向。在上世紀(jì)六十年代，灌注培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)開辟了廣闊的前景。在隨后的研究中，灌注培養(yǎng)技術(shù)得到了迅速發(fā)展，已成為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的重要方法。灌注培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)是連續(xù)灌注的培養(yǎng)基可以提供充分的營養(yǎng)成分，并帶走代謝副產(chǎn)物，而細(xì)胞保留在反應(yīng)器系統(tǒng)中，由于細(xì)胞生長環(huán)境優(yōu)良，可以達(dá)到很高的細(xì)胞密度，并延長表達(dá)時間、增大收獲體積，同其它方法相比，灌注培養(yǎng)的產(chǎn)率可以提高很多。

1 懸浮灌注培養(yǎng)

1.1 微載體懸浮灌注培養(yǎng)

微載體培養(yǎng)最先是由A1 L1 Van Wezel提出，其方法是在細(xì)胞培養(yǎng)時，將細(xì)胞懸液與經(jīng)過特殊處理的微載體混合培養(yǎng)，待細(xì)胞貼附于微載體上后移至培養(yǎng)液中培養(yǎng)，借助攪拌系統(tǒng)使細(xì)胞隨載體均勻懸浮于培養(yǎng)液中。近年來隨著對微載體材料的深入探索，相繼開發(fā)出液體微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA 微載體、藻酸鹽凝膠微載體等，并有很多微載體已進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，如明膠微載體Gelibead 、Cultispher 、Cytodex3和Microsphere以及大孔的Cellsnow和Cytopore等。

1.2 懸浮細(xì)胞截流灌注培養(yǎng)

隨著無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)的日趨成熟，現(xiàn)有細(xì)胞密度及表達(dá)量已不能滿足需求，人們重新將目光轉(zhuǎn)移到灌注培養(yǎng)上，但是如何不用微載體而將細(xì)胞截流在反應(yīng)器中并結(jié)合無血清懸浮培養(yǎng)工藝進(jìn)行產(chǎn)物的表達(dá)成為熱門。該工藝的重點(diǎn)在細(xì)胞截流上，如何高效的截流細(xì)胞而不對細(xì)胞產(chǎn)生損害及降低堵塞成為焦點(diǎn)。

1.2.1 中空纖維柱細(xì)胞截流裝置

中空纖維柱是由若干根孔徑在10kd-0.45um的圓筒形膜束捆綁在一起構(gòu)成的，含細(xì)胞液由圓筒中間快速通過形成切向流，因膜的孔徑小于細(xì)胞直徑，因此細(xì)胞被截流在膜內(nèi)側(cè)，而培養(yǎng)液透過膜滲出到膜外側(cè)而達(dá)到截流細(xì)胞的目的。當(dāng)前該種灌注培養(yǎng)裝置最具代表的就是ATF System(Refine TECHNOLOGY ），其特有技術(shù)可有效防止柱體的堵塞，達(dá)到長時間截流細(xì)胞的目的。據(jù)報道，應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)密度可達(dá)4-15×107個/ml，蛋白產(chǎn)量可達(dá)1g/L/day甚至更高。

圖1 ATF系統(tǒng)運(yùn)行示意圖

1.2.2 沉降法細(xì)胞截流

在眾多的細(xì)胞截留裝置中，傾斜式重力沉降器由于設(shè)備簡單、對細(xì)胞造成的損傷較小、操作簡易，已用于雜交瘤和CHO 細(xì)胞連續(xù)灌注培養(yǎng)，在采用上流式沉降操作的連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了高密度培養(yǎng)。但該系統(tǒng)在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時還存在諸如細(xì)胞損失、灌注流速過慢等問題而限制了系統(tǒng)的放大，無法應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。

1.2.3 聲學(xué)細(xì)胞截流裝置

這是一種基于聲頻引起細(xì)胞聚集的新型細(xì)胞截留裝置，BioSep聲學(xué)細(xì)胞截流設(shè)備（Applikon ）的原理完全是基于溫和的聲頻引起松的細(xì)胞積聚，然后再沉淀。與其他的細(xì)胞分離技術(shù)相比，BioSep內(nèi)的聲頻能量網(wǎng)構(gòu)成一個“虛擬網(wǎng)”，因而是更好的，無接觸、不移動的過濾模式。該技術(shù)可以進(jìn)行長達(dá)數(shù)千小時的連續(xù)培養(yǎng)，因而大大提高細(xì)胞密度、生產(chǎn)率并獲得高的產(chǎn)品質(zhì)量。

1.2.4 離心細(xì)胞分離

該方法較為簡單，即在無菌條件下利用重力離心分離細(xì)胞與培養(yǎng)液，但該方法使細(xì)胞受到的剪切力較大，對細(xì)胞損傷較大，另外，對操作環(huán)境要求較高及離心機(jī)體積上的限制而無法應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，僅在研究中應(yīng)用。

2 床層灌注培養(yǎng)

2.1 流化床培養(yǎng)

利用一些諸如磁、電場等技術(shù)手段將微載體局限于一定區(qū)域內(nèi)，細(xì)胞生長于多孔微載體內(nèi)部，培養(yǎng)基在流通過程中不會損失細(xì)胞，該培養(yǎng)方式適用于貼壁依賴型細(xì)胞，具有培養(yǎng)基交換快，細(xì)胞養(yǎng)分充足的特點(diǎn)。

2.2 固定床培養(yǎng)

是將微載體固定于無菌容器內(nèi)，細(xì)胞貼附生長在載體上或載體內(nèi)部，進(jìn)行培養(yǎng)液更換時，微載體并不移動，可很大程度上降低血清的用量。

2.2.1 中空纖維灌注培養(yǎng)

由于中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)具有類似于生理狀態(tài)的纖維毛細(xì)管模式和灌注式培養(yǎng)基循壞系統(tǒng), 既有利于高密度細(xì)胞在纖維管壁和周圍的停留、生長和增殖, 也便于營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)和代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移, 近年來, 已被越來越多地用于雜交瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

2.2.2 堆積床培養(yǎng)

該方式是將反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長。

篇9

[關(guān)鍵詞] 雪旺氏細(xì)胞；培養(yǎng)；人

[中圖分類號] R421 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2012）06（a）-0025-02

雪旺氏細(xì)胞（SCs）是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中一種功能特殊的膠質(zhì)細(xì)胞，是周圍神經(jīng)中神經(jīng)鞘的主要組成部分。近年來發(fā)現(xiàn)，SCs不僅能維持周圍神經(jīng)正常的電生理傳導(dǎo)功能，還在神經(jīng)損傷后修復(fù)再生過程中起重要的作用[1]。研究表明[2]，SCs在周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)過程中，主要是通過分泌多種神經(jīng)生長因子，維持神經(jīng)元的存活；另一方面，SCs還通過產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞黏附分子等，在神經(jīng)軸突的再生過程中起支持和引導(dǎo)的作用。利用SCs的這種特性，將SCs作為一種支持細(xì)胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)上，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中發(fā)揮巨大的作用[3]。作為細(xì)胞移植前的基礎(chǔ)工作，本實(shí)驗探討從人胚胎脊髓背根中分離、培養(yǎng)并純化人SCs。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；0.125%胰蛋白酶-EDTA（Gibco公司）；膠原酶（Sigma公司）；Forskolin、牛腦垂體提取液（BT1，Sigma公司），阿糖胞苷（Sigma公司），D-Hanks平衡液，CO2培養(yǎng)箱（NAPCO公司），倒置相差顯微鏡（Olympus公司），35 mm一次性培養(yǎng)皿，多聚賴氨酸，兔抗人S-100（Neomarkers公司）；即用型SABC免疫組化試劑盒和褐色DAB顯色試劑盒，均購自博士德公司；引產(chǎn)的28周死亡胎兒（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供）。

1.2 雪旺氏細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

從引產(chǎn)的28周胎兒中分離背根神經(jīng)，將背根神經(jīng)在D-Hanks平衡液中切成小塊，在37℃下加入膠原酶進(jìn)行消化約1 h，后加入等量含10%胎牛血清、青酶素和鏈酶素的DMEM溶液中止消化。800 r/min離心5 min，移除上清，加入2 mL的DMEM，用火焰拋光的吸管進(jìn)行吹打，將吹打后的細(xì)胞懸液用微孔大小約10 μm的濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液移入用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，置搖床上每隔10 min 搖10 s，總共搖30 s，將雪旺氏細(xì)胞與混雜在其中的成纖維母細(xì)胞進(jìn)行分離。將上層的細(xì)胞懸液移入另外一個培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，原培養(yǎng)瓶中底部沉淀的成纖維母細(xì)胞和少量的雪旺細(xì)胞加入10 mL的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，約4 h后，原培養(yǎng)瓶再進(jìn)行震搖，將懸浮細(xì)胞移入另一培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，原培養(yǎng)瓶中余下的細(xì)胞大部份為成纖維母細(xì)胞。將上述方法取材、消化、純化后的細(xì)胞懸液種植于含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，于5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h后，更換成含阿糖胞苷（終濃度為5 μg/mL）和20% FBS的DMEM培養(yǎng)液，48 h左右更換成含有Forskolin及BT1生長促進(jìn)劑的培養(yǎng)液，每周2～3次。待細(xì)胞長滿皿底后以0.125%的胰蛋白酶-EDTA液消化1～2 min，同時鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始皺縮后加入含血清培養(yǎng)液中止消化，離心（1 500 r/min，5 min），加入適量培養(yǎng)液，用拋光的吸管吹打，稀釋后接種在預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的35 mm培養(yǎng)皿中。靜置5～15 min，吸出上清液，離心（1 500 r/min，5 min），加適量培養(yǎng)液， 用拋光的吸管吹打，均勻后重新接種于另一只預(yù)先涂布多聚賴氨酸的35 mm培養(yǎng)皿中，于5% CO2，37℃條件下培養(yǎng)。

1.3 S-100免疫組化法鑒定SCs及純度

反復(fù)傳代后，待P4代SCs長滿底部后，以3%甲醛固定10 min，PBS沖洗3次。加入一抗兔抗人S-100多克隆抗體（1∶100），4℃過夜；0.1 mol/L PBS沖洗3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS漂洗2 min×3次；滴加試劑SABC，20～37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS漂洗5 min×4次；DAB（用蒸餾水1 mL加試劑盒中A，B，C試劑各1滴），室溫下顯色5～30 min。顯微鏡下觀察，S-100陽性細(xì)胞為SCs。細(xì)胞純度采用抽樣法進(jìn)行統(tǒng)計。該方法大略如下：用一帶網(wǎng)格的蓋玻片在顯微鏡下對S100抗原陽性細(xì)胞（雪旺氏細(xì)胞）和S-100抗原陰性細(xì)胞（非雪旺氏細(xì)胞）進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。第一個計數(shù)區(qū)域選擇在蓋玻片中央部位，計數(shù)后水平或垂直移動蓋玻片2 mm，再進(jìn)行計數(shù)，依同樣的方法共計數(shù)9個區(qū)域，最后再進(jìn)行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

細(xì)胞懸液種植2～4 h后，倒置顯微鏡下觀察，剛貼壁的SCs呈小而圓，折光性好，少數(shù)呈雙極或三極的梭形；成纖維細(xì)胞胞體較大，形狀不規(guī)則，較SCs貼壁更早，黏附更牢。24 h后大部分細(xì)胞完全貼壁，大多數(shù)細(xì)胞呈兩端突起的梭形，少量呈多角形，相鄰細(xì)胞之間以突起相連（圖1）；在這些梭形細(xì)胞中間，夾雜一些散在分布，形狀不規(guī)則，細(xì)胞個體較大的細(xì)胞，這些細(xì)胞是纖維母細(xì)胞。加用阿糖胞苷后，有少量的細(xì)胞胞體變黑浮起，細(xì)胞增殖明顯受抑制，成纖維母細(xì)胞受抑制更明顯。細(xì)胞生長融合延緩，第6～9天細(xì)胞才長滿皿底部。經(jīng)傳代后SCs純度明顯提高。

免疫組織化學(xué)檢測，SCs被染成黃褐色（圖2），而成纖維母細(xì)胞不著色。示SCs呈S-100抗原陽性。細(xì)胞純度統(tǒng)計示SCs純度達(dá)99%。

3 討論

有研究表明[4]，SCs能分泌20多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的分子量分布在15～250 kD之間，這其中就包括多種神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTFs），這些神經(jīng)營養(yǎng)因子中，NGF、CNTF、BDNF和FGF研究較多。有研究表明，單一的神經(jīng)營養(yǎng)因子既能維持某些神經(jīng)元的生存，又能促進(jìn)其突起生長，而多種神經(jīng)營養(yǎng)因子在一起可能有協(xié)同的生理效應(yīng)，即他們可能作用于相同的受體，起協(xié)同作用。將SCs移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，SCs能長期存活并分泌神經(jīng)生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)，這將在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中起到很重要的作用[5-6]。近年來，SCs細(xì)胞中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植作為支持細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究很多，部分研究已經(jīng)應(yīng)用于臨床[7-8]。因此，探索人SCs的分離、培養(yǎng)和純化方法對人類有著迫切的需要。

目前SCs細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法已經(jīng)較為成熟，難點(diǎn)在于與成纖維母細(xì)胞的分離[9]。由于兩種細(xì)胞的貼壁特性的不同，成纖維母細(xì)胞的貼壁時間更早，貼壁更牢固，因此，可以利用兩種細(xì)胞的這種特性對其進(jìn)行分離。本實(shí)驗在原代培養(yǎng)階段，將經(jīng)過酶消化后的混懸液置于用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，在搖床上進(jìn)行振搖，SCs在這種條件下貼壁很少，而成纖維母細(xì)胞由于較易貼壁，大部份附著于瓶底，通過提取上清液，達(dá)到SCs與成纖維母細(xì)胞的分離。在分瓶傳代過程中，利用成纖維母細(xì)胞貼壁較牢固的特性，通過調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)南傅臐舛?，使大部份SCs懸浮，而成纖維母細(xì)胞仍然處于貼壁狀態(tài)，通過提取上清液的方法，既而與底部成纖維母細(xì)胞分離。通過不斷的傳代培養(yǎng)，使SCs不斷純化。由于阿糖胞苷對兩種細(xì)胞的生長抑制程度不同，在培養(yǎng)液中加入阿糖胞苷，抑制成纖維母細(xì)胞的生長，使SCs的增殖速對相對于成纖維母細(xì)胞快，從而達(dá)到減少成纖維母細(xì)胞，提高SCs純度的目的。本實(shí)驗綜合利用酶消化、時間差和阿糖胞苷抑制等方法分離、培養(yǎng)和純化人SCs，經(jīng)鑒定，這些細(xì)胞呈S-100抗原陽性，純度達(dá)99%。本實(shí)驗為將來臨床利用SCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷奠定基礎(chǔ)。

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篇10

【關(guān)鍵詞】軟骨細(xì)胞 提取 培養(yǎng)

軟骨細(xì)胞作為軟骨組織在軟骨基質(zhì)中唯一存在的特定的細(xì)胞種類，在軟骨組織再生與代謝方面起到了重要作用。但因軟骨組織中缺少血管和神經(jīng)系統(tǒng)，其自身修復(fù)方面存在一定的局限性。近些年，生物組織工程學(xué)將工程學(xué)和生命科學(xué)的方法原理相互結(jié)合構(gòu)建人體組織或器官的功能替代物。在軟骨組織工程中，體外構(gòu)建的自體軟骨細(xì)胞組織復(fù)合物可移植到機(jī)體受損關(guān)節(jié)修復(fù)其結(jié)構(gòu)并恢復(fù)原有功能。自體軟骨組織移植技術(shù)已引起人們越來越多的重視，但由于機(jī)體軟骨組織中的軟骨細(xì)胞相對較少，無法滿足機(jī)體受損關(guān)節(jié)修復(fù)和愈合所需的軟骨細(xì)胞數(shù)量；并且軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增的過程中，會發(fā)生“去分化”現(xiàn)象。發(fā)生了去分化現(xiàn)象的軟骨細(xì)胞則不宜再用于軟骨組織工程。因此，本實(shí)驗通過結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)，試圖探討通過簡易的方法來獲取大量活性化、增殖能力強(qiáng)的軟骨細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試劑

2月齡新西蘭大白兔1只（由蘇州大學(xué)動物實(shí)驗中學(xué)提供），體重1.5kg。II型膠原酶（collagenase type II）、HEPES液、脯氨酸、抗壞血酸及非必須氨基酸均由Sigma公司提供；高糖DMEM、PBS從Hyclone購買；胎牛血清、青鏈霉素由Gibco公司提供；cck8試劑購自國產(chǎn)碧云天。

1.2 軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

耳緣靜脈空氣栓塞法處死新西蘭兔，75%酒精消毒雙側(cè)膝關(guān)節(jié)。將關(guān)節(jié)以及周圍肌肉組織完全離斷，75%醫(yī)用酒精浸泡消毒后，放入含有雙抗的PBS液中。在超凈臺上分離關(guān)節(jié)，剔除周圍的軟組織。仔細(xì)清除軟骨表面的滑膜，用刀片削下透明軟骨，放入含2ml PBS的5ml EP管中，并用PBS清洗3次。去掉PBS后，加入4ml 0.2%II型膠原酶，并移入15ml離心管中，放入37℃恒溫?fù)u床振蕩消化。消化過程中，觀察到約3h，軟骨組織已全部變?yōu)樾鯛?。將?xì)胞懸濁液經(jīng)過200目濾網(wǎng)過濾，收集到的軟骨細(xì)胞分別按2000個/孔接種于96孔板、5000個/cm2接種于25cm2培養(yǎng)瓶。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并每3天換液一次。

1.3 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液的組成

對照組：高糖DMEM培養(yǎng)基，添加10% FBS和1%雙抗。實(shí)驗組是在對照組的基礎(chǔ)上，添加0.1mM非必須氨基酸、10mM HEPES液、0.4mM脯氨酸、50mg/L抗壞血酸。

1.4 原代軟骨細(xì)胞貼壁和增殖情況

（1）細(xì)胞貼壁情況：原代細(xì)胞接種24h后，每天于倒置顯微鏡下觀察貼壁生長情況并拍照。

（2）cck8法檢測細(xì)胞增殖：原代細(xì)胞按2000個/孔的密度接種于96孔板，設(shè)5個復(fù)孔，接種后1-10d每天測得其吸光值（OD490）。測定前每孔加入10ul cck8溶液，放置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。2h后于酶標(biāo)儀檢測OD490。

2 結(jié)果

2.1 原代軟骨細(xì)胞的貼壁情況及形態(tài)學(xué)觀察

原代軟骨細(xì)胞接種后，分別按實(shí)驗組和對照組的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)觀察7d。原代分離的軟骨細(xì)胞為圓球形，懸浮于培養(yǎng)基中；實(shí)驗組，24h后細(xì)胞開始貼壁，逐漸展開，第3天時細(xì)胞基本均已展開呈多角形，在增殖過程中，出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象，至第6天，細(xì)胞可長滿瓶底，單層生長的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“鋪路石”樣表現(xiàn)；而對照組的細(xì)胞，在48h才開始貼壁，第4天細(xì)胞基本展開呈多角形，第7天時呈現(xiàn)“鋪路石”樣。

2.2 原代軟骨細(xì)胞的增殖情況

通過cck8法檢測了實(shí)驗組和對照組細(xì)胞連續(xù)9d的增殖情況。實(shí)驗組的細(xì)胞在接種第2天即開始增殖，而對照組的細(xì)胞從第4天才開始明顯增殖，實(shí)驗組細(xì)胞的增殖率明顯高于對照組。

3 討論

隨著社會快速發(fā)展，人口老齡化的問題日趨嚴(yán)重，伴隨而來的關(guān)節(jié)軟骨損傷的發(fā)病率也出現(xiàn)持續(xù)升高。因軟骨組織缺乏血液和神經(jīng)供應(yīng)，其自身修復(fù)能力較差，故軟骨損傷的治療問題一直是醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。近年來，軟骨組織工程技術(shù)已成為治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的重要手段，而足夠數(shù)量的高質(zhì)量種子細(xì)胞的來源則是組織工程軟骨構(gòu)建的關(guān)鍵。

本研究在軟骨細(xì)胞的消化分離過程中，清除軟骨表面的滑膜組織后，采用對細(xì)胞毒性較小的0.2% II型膠原酶消化，可以減輕胰酶對軟骨細(xì)胞的傷害。置于37℃恒溫?fù)u床振蕩，可以在較短時間內(nèi)使軟骨消化更徹底。本實(shí)驗中，1只兔的雙膝關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)3h左右的消化后已可完全消化，收集細(xì)胞后計數(shù)可達(dá)500萬，且細(xì)胞的活性較高，貼壁率達(dá)90%以上。本消化方法較很多文獻(xiàn)報道中的聯(lián)合酶消化法等，具有步驟簡單、耗時短、污染率低、獲取細(xì)胞數(shù)量多等特點(diǎn)。

在軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)中，我們發(fā)現(xiàn)，使用添加了HEPES液、非必須氨基酸、脯氨酸及抗壞血酸的培養(yǎng)基可以促進(jìn)原代軟骨細(xì)胞的貼壁和增殖，且pei等表明這種培養(yǎng)基可以利于軟骨細(xì)胞表型的維持。因此，在軟骨組織工程中體外準(zhǔn)備種子細(xì)胞時可以考慮使用該培養(yǎng)基，以獲取更多具有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)：

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