導(dǎo)語：消化系統(tǒng)非癌組織細(xì)胞突變的意義一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】體細(xì)胞突變隨著機(jī)體衰老而不斷積累，進(jìn)而驅(qū)動癌癥的發(fā)生發(fā)展，而慢性炎癥、誘變劑暴露等因素則大大加速該過程。描繪并理解非癌組織細(xì)胞如何累積和選擇這些突變，對于認(rèn)識癌癥的發(fā)生發(fā)展過程至關(guān)重要，但目前人們在這方面的認(rèn)識仍非常有限。借助近年來快速發(fā)展的高通量高深度二代測序技術(shù)，人們得以逐漸清晰地認(rèn)識非癌組織細(xì)胞中的突變累積及克隆演進(jìn)動力學(xué)。非癌組織細(xì)胞中的突變具有廣泛性、克隆性、選擇性，既有可能影響腫瘤發(fā)生，也有部分突變利于組織修復(fù)及再生。這些研究成果加深了人們對非癌組織細(xì)胞突變導(dǎo)致組織穩(wěn)態(tài)失衡及腫瘤發(fā)生的認(rèn)識，為探究癌癥的起源提供了新的方向和思路。在此，本文對更新活躍、易于突變累積的消化系統(tǒng)器官(食管、結(jié)直腸、肝臟組織)在本領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以豐富本問題的認(rèn)知。

【關(guān)鍵詞】體細(xì)胞突變;非癌組織;食管;結(jié)直腸;肝臟

突變是指生物體、病毒基因組核苷酸序列的改變。造成突變的可能原因包括染色體重組、DNA錯誤復(fù)制、DNA修復(fù)機(jī)制缺陷、誘變劑暴露、病毒感染等。突變通過核苷酸替換、片段插入或缺失、染色體重排和拷貝數(shù)變化等方式，在一級結(jié)構(gòu)上改變DNA序列，進(jìn)而導(dǎo)致編碼蛋白量和質(zhì)的變化［1］。一方面，突變是自然選擇的最初來源，是生物進(jìn)化的動力;另一方面，經(jīng)典理論認(rèn)為，關(guān)鍵癌基因、抑癌基因或其調(diào)控序列上發(fā)生的突變則是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因:突變將賦予早期腫瘤細(xì)胞克隆擴(kuò)增優(yōu)勢，以及不受控制的生長、組織侵襲破壞、血管生成和逃避凋亡等能力。上述機(jī)制不斷驅(qū)動基因在腫瘤細(xì)胞中正向選擇，并造成腫瘤細(xì)胞克隆擴(kuò)增，最終形成腫瘤演進(jìn)過程中的正反饋，促進(jìn)腫瘤形成和發(fā)展［2-3］。然而，在形態(tài)正常的細(xì)胞中，突變是如何選擇與累積的，細(xì)胞的生物學(xué)行為又是如何受其影響的，人們在這方面的認(rèn)識尚較為有限。

1發(fā)現(xiàn)非癌組織細(xì)胞突變的測序技術(shù)

從測序通量與準(zhǔn)確性上來說，一代測序(Sanger測序法)雖是鑒定DNA序列改變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其通量低、操作繁瑣費(fèi)時的弊端限制了人們對突變基因集的整體認(rèn)識［4］。如今，以Illumina等公司為代表的二代測序技術(shù)利用橋式擴(kuò)增及多片段拼接原理，則可對DNA進(jìn)行高通量突變檢測，比如全基因組測序(wholegenomesequencing，WGS)及全外顯子測序技術(shù)(wholeexomesequencing，WES)。在二代測序平臺上，WGS可對生物體整個基因組序列進(jìn)行測序，以獲得完整的基因組信息;WES可以檢測基因組上編碼區(qū)的突變情況，能夠發(fā)現(xiàn)直接影響蛋白質(zhì)氨基酸序列的遺傳變異，目標(biāo)性更強(qiáng)，測序成本也相對低廉，測序后數(shù)據(jù)的分析也相對簡單［5］。對于非癌組織細(xì)胞來說，突變往往僅存在于分散且數(shù)量有限的克隆之中［6］，因此，識別非惡性組織中的體細(xì)胞突變，需要通過足夠深度的測序才有可能得以實(shí)現(xiàn)［7-8］。近年來，隨著高通量深度測序技術(shù)的發(fā)展，人們在非癌組織中發(fā)現(xiàn)了越來越多的突變累積，比例甚至高達(dá)37%。也就是說，在100個非癌形態(tài)和/或非癌生物學(xué)行為的“正?！奔?xì)胞中，有近40%帶有不同程度的基因突變［9-10］。這些帶有突變的細(xì)胞群以小克隆的形式存在，在組織發(fā)育及細(xì)胞命運(yùn)決定方面發(fā)揮著未被認(rèn)識的新功能。目前，已在食管［11-13］、結(jié)直腸［14-16］、肝臟［17-19］、皮膚［20］、支氣管［21］、子宮內(nèi)膜［22-23］、尿路上皮［24-25］、血液［26-28］等多種類型的非癌組織中發(fā)現(xiàn)有體細(xì)胞突變的存在。其中，食管、結(jié)直腸上皮黏膜及肝臟是人體更新最為活躍的部位之一，此處的非癌組織突變易于產(chǎn)生“放大效應(yīng)”，因此，本文主要就前三種消化系統(tǒng)器官組織的非癌細(xì)胞突變作一概述。

2非癌組織細(xì)胞突變的發(fā)現(xiàn)及其意義

借助超深度的測序技術(shù)，人們得以在非癌組織中探究體細(xì)胞突變情況。在某些情況下，部分發(fā)生突變的基因呈現(xiàn)聚類趨勢，稱為突變特征(mutationalsigna-ture，MS)。目前，人們已發(fā)現(xiàn)一百多種不同的MS，包括由紫外線照射或吸煙等外部因素引起的MS、由DNA修復(fù)機(jī)制缺陷等內(nèi)在因素引起的MS兩大類。MS的發(fā)現(xiàn)揭示了癌癥發(fā)生中突變過程的多樣性，對理解癌癥的病因、提出新的治療和預(yù)防措施均具有重要意義［1，29-31］。

2．1食管

食管是人體中最容易接觸外源物質(zhì)的器官之一，食管上皮細(xì)胞直接接觸多種外源性刺激物，大大增加了突變的發(fā)生概率。Martincorena等［11］對9名20～75歲的志愿者的食管上皮樣本進(jìn)行了平均覆蓋率為37×的全基因組測序以及74個癌基因的超深度(870×)靶向測序，鑒定出了8919個體細(xì)胞編碼突變，并發(fā)現(xiàn)突變數(shù)量及突變克隆的大小隨著志愿者年齡的增長而增加，為突變累積學(xué)說提供了確切證據(jù)。對突變基因的分析結(jié)果顯示:在角質(zhì)形成細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用的信號通路相關(guān)分子(NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、TP63、AJUBA)、細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)分子(NFE2L2、TP53)、細(xì)胞周期蛋白(CCND1)、蛋白質(zhì)修飾分子(PIK3CA、CUL3)、表觀調(diào)控分子(KMT2D)均存在不同程度的突變累積，其中至少有11個基因與食管鱗狀細(xì)胞癌(esophagealsquamouscarcinoma，ESCC)的發(fā)生密切相關(guān)。有趣的是，該研究還發(fā)現(xiàn)NOTCH1在食管非癌細(xì)胞中的突變頻率遠(yuǎn)超癌變細(xì)胞。除NOTCH1基因外，Yokoyama等［13］在不同年齡、不同生活方式的139例ESCC患者中發(fā)現(xiàn)，非癌組織的PPM1D、NOTCH2、ZFP36L2、FAT1、NOTCH3、CHEK2和PAX9的突變頻率均顯著高于ESCC。這些以往被歸為促癌基因的分子在非癌組織中的突變累積更高，提示這些癌基因仍為野生型的食管上皮更易發(fā)生腫瘤，刷新了人們的認(rèn)識。此外，研究者在非癌食管組織的樣本中總結(jié)了與重度吸煙、酗酒等生活方式相關(guān)的MS，并發(fā)現(xiàn)了與載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽家族(apolioproteinBmRNA-editingenzymecatalyticpolypeptide，APOBEC)等酶活性相關(guān)的MS，提示對于已出現(xiàn)酶活性MS的潛在ESCC患者來說，改善生活習(xí)慣可能為其帶來更大的獲益［32］。衰老通過累積突變使組織細(xì)胞獲得多克隆性，是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一［33-34］。上述研究均發(fā)現(xiàn)衰老食管上皮中累積的突變與腫瘤中存在的突變存在部分重合，這提示ESCC發(fā)生后，細(xì)胞獲得突變的速率及頻率大大增加，可能是腫瘤演進(jìn)的關(guān)鍵原因。進(jìn)一步了解非癌食管組織中的突變情況，借此篩選出癌組織中的獨(dú)有突變，這有助于發(fā)現(xiàn)并鑒定更多的癌基因，從而為腫瘤早期診斷和靶向治療提供重要指導(dǎo)。

2．2結(jié)直腸

結(jié)直腸癌在全球發(fā)病率排名第三，死亡率排名第二［35］。不良的生活行為如高脂飲食、長期吸煙及酗酒均是結(jié)直腸癌發(fā)生的高危因素［36-37］。腸壁中廣泛分布的三級淋巴器官、腸腔中高豐富度的腸菌生態(tài)與外源物質(zhì)、腸道上皮黏膜高度活躍的更新周期，這些特點(diǎn)使結(jié)直腸更易于受到急慢性炎癥攻擊。Lee-Six等［14］利用顯微切割及WES技術(shù)，在11～78歲志愿者的2035個非癌結(jié)腸隱窩中發(fā)現(xiàn)了可能驅(qū)動腫瘤發(fā)生的突變集，其中包括抑癌基因如AXIN2、STAG2及具有典型錯義突變的癌癥基因如PIK3CA、ERBB2、ERBB3、FBXW7等。研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，正常結(jié)直腸上皮、腺瘤、結(jié)直腸癌細(xì)胞中基因突變的相對頻率也各不相同，例如:結(jié)直腸癌中APC、KRAS、TP53的突變非常普遍，但在非癌隱窩中非常稀少;而ERBB2、ERBB3等驅(qū)動突變在非癌隱窩中普遍存在，但在結(jié)直腸癌細(xì)胞中則較為少見。就這一點(diǎn)來說，結(jié)直腸上皮非癌性細(xì)胞與癌性細(xì)胞的突變模式是與以往認(rèn)識相吻合的。潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)是結(jié)直腸癌發(fā)生的高危因素。與健康個體相比，UC患者結(jié)腸上皮細(xì)胞處于慢性炎癥微環(huán)境中，較多的炎癥因子及自由基分子使得細(xì)胞可能出現(xiàn)較高頻率的基因突變［38］。Kakiuchi等［15］對健康人及UC患者的腸道隱窩分別進(jìn)行全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)UC患者中存在多克隆性的隱窩重塑。在這些由NFKBIZ、TRAF3IP2、ZC3H12A、PIGR、HNRNPF等基因突變而被正向選擇的克隆中，上皮間質(zhì)細(xì)胞中IL-17和其他促炎信號均處于明顯下調(diào)狀態(tài)，提示上述正常隱窩中的基因突變兼有降低免疫反應(yīng)的功能。一方面可能是慢性炎癥過程中的適應(yīng)性改變，對機(jī)體有益;但另一方面，帶有突變的克隆間質(zhì)處于免疫抑制狀態(tài)，也可能為腫瘤發(fā)生過程中的免疫逃逸現(xiàn)象提供了分子基礎(chǔ)。在長期慢性炎癥狀態(tài)下，血液中的PBMC也可能存在突變［26-27］。為排除這種因素的干擾，Nanki等［16］在除去免疫細(xì)胞中可能存在的突變后，利用人結(jié)直腸類器官模型及WES，進(jìn)一步驗(yàn)證了NFKBIZ、ZC3H12A和PIGR在UC患者中處于突變狀態(tài)。但UC患者腸上皮細(xì)胞中普遍存在的NFKBIZ突變卻較少出現(xiàn)在UC相關(guān)性結(jié)直腸癌中，這提示結(jié)直腸癌發(fā)生過程中存在針對NFKBIZ突變細(xì)胞的負(fù)向選擇機(jī)制，NFKBIZ突變不利于結(jié)直腸癌發(fā)生。這個推測在NobuyukiKakiuchi的NFKBIZKO突變小鼠模型中得以驗(yàn)證:研究人員發(fā)現(xiàn)帶有該突變的小鼠在誘變劑的處理下，結(jié)直腸腫瘤發(fā)生比例也顯著降低，這可能與NFKBIZ突變不利于結(jié)直腸上皮細(xì)胞生存有關(guān)［16］。上述研究不僅描述了結(jié)直腸癌發(fā)生過程中隱窩攜帶驅(qū)動突變，并在腫瘤演進(jìn)過程中逐漸建立選擇優(yōu)勢的路徑;也同時展示了結(jié)直腸癌突變克隆的范圍、驅(qū)動突變頻率等演進(jìn)動力學(xué)指標(biāo)，有助于深化人們對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的理解。

2．3肝臟

肝臟是人體重要代謝器官，大多數(shù)的藥物及毒物均在肝臟中進(jìn)行分解代謝，而部分代謝產(chǎn)物具有比原形更活躍的促突變能力，這一特點(diǎn)使肝臟更易暴露于促突變物質(zhì)中。另一方面，肝臟是一個易于受到炎癥、缺血缺氧等內(nèi)部因素打擊的器官。同時，肝炎病毒、酗酒等因素是導(dǎo)致肝臟慢性損傷的重要原因［39-41］，也是突變產(chǎn)生的重要因素。這些特點(diǎn)使肝癌的發(fā)生率占據(jù)所有惡性腫瘤的第五位［35］。為揭示肝癌發(fā)生的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，Kim等［18］研究了肝癌高危病變—肝硬化中再生結(jié)節(jié)(regenerativenodule，RN)組分細(xì)胞的突變情況。對205個肝硬化RN進(jìn)行了30個腫瘤相關(guān)基因的深度靶向測序，在其中47個RN中檢測到陽性結(jié)果:HCV相關(guān)RN中含有ARID1A、ARID2和TP53的體細(xì)胞突變;HBV相關(guān)RN中發(fā)現(xiàn)了NCOR1、TSC1和CDKN1A的體細(xì)胞突變;提示病毒感染相關(guān)的RN可以獲得具有癌癥相關(guān)基因突變的細(xì)胞亞群，為研究肝炎－癌轉(zhuǎn)化的機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)。令人意外的是，這205個RN中均未檢測到端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)啟動子突變，提示TERT激活可能是肝硬化RN發(fā)展為肝細(xì)胞癌的關(guān)鍵因素。除此之外，Brunner等［17］通過對482個正常肝組織和肝硬化組織的顯微切割樣本進(jìn)行70×WGS，發(fā)現(xiàn)在正常肝細(xì)胞存在1%～5%的突變驅(qū)動克隆;在正常肝組織和肝硬化樣本的突變數(shù)據(jù)中，均包含抑癌基因ACVR2A、ARID2、ARID1A、TSC2等基因的失活突變，但腫瘤中的差異突變則只剩下ACVR2A，并帶有較多ALB突變。ALB編碼白蛋白，在正常肝組織中具有較高的轉(zhuǎn)錄頻率，在該項(xiàng)研究中由于插入缺失突變而失活。這似乎提示插入缺失突變可能優(yōu)先發(fā)生在多次轉(zhuǎn)錄的模板基因中。高轉(zhuǎn)錄活性的基因?yàn)楹我子诎l(fā)生插入缺失突變，這同樣是一個值得深入探究的科學(xué)問題。有意思的是，Zhu等［19］通過CRISPR技術(shù)建立小鼠基因突變模型，對測序結(jié)果突變頻率較高的PKD1、KMT2D、ARID1A等基因進(jìn)行了體內(nèi)水平的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這些突變在一定程度上能促進(jìn)肝組織再生。這提示并不是所有的突變均只是單方面的有害突變，有些還可能有助于增加肝細(xì)胞的適度再生，有益于肝臟功能。肝臟具有的MS集合有助于解釋其從慢性肝病到肝癌的復(fù)雜轉(zhuǎn)變過程。慢性肝病組織比正常肝臟脂質(zhì)存在更多高度動態(tài)變化的克隆，這些克隆被纖維化帶所隔離，具有顯著區(qū)域性特征。值得注意的是，肝臟非癌組織帶有的部分突變既可能促進(jìn)肝組織再生，也可具有促進(jìn)腫瘤的潛能。這些突變?nèi)绾卧趽p傷修復(fù)－腫瘤發(fā)生過程中“博弈”?其綜合效應(yīng)為何?可能更大程度上依賴于突變特征以及克隆規(guī)模，尚有待于進(jìn)一步研究。

3展望

由于很難捕捉到非癌組織“突破”至早期腫瘤的節(jié)點(diǎn)，因此大多數(shù)非癌細(xì)胞累積突變的研究樣本只能取自已經(jīng)發(fā)生腫瘤的手術(shù)患者。對處于腫瘤發(fā)生最起始階段細(xì)胞的突變研究仍非常有限，造成我們對腫瘤起源細(xì)胞的性質(zhì)、突變時空節(jié)點(diǎn)、所涉及的遺傳事件和分子機(jī)制以及這些事件如何受到微環(huán)境或接觸致癌物的影響等，至今仍知之甚少。另一方面，基因突變頻率也并不是腫瘤發(fā)生與否的唯一決定因素，發(fā)生突變的基因?qū)?xì)胞發(fā)育的影響程度也同樣重要。這就要求后續(xù)研究不僅要發(fā)現(xiàn)更多、更早期的突變，且更需要在患者長期隨訪或轉(zhuǎn)基因動物模型中對突變基因功能進(jìn)行驗(yàn)證，以為腫瘤發(fā)生提供更為堅(jiān)實(shí)的證據(jù)。這個過程可能艱難而漫長，但也許將會帶來上世紀(jì)七八十年代后癌基因發(fā)現(xiàn)的另一個高峰。通過超深度測序技術(shù)對非癌組織進(jìn)行的深入研究，可能會取得意料之外的收獲。前文已述，出現(xiàn)在一些慢性疾病(如慢性肝病)組織細(xì)胞中的突變可能會通過促進(jìn)組織再生發(fā)揮對機(jī)體保護(hù)作用，這種現(xiàn)象在未來可能會成為解決一些慢性疾病治療的關(guān)鍵，同樣值得深入研究。

作者：喻博 崔紅娟 陳東風(fēng) 王濤 陸軍 單位：軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院消化內(nèi)科 西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院癌癥研究中心