導(dǎo)語(yǔ)：人工關(guān)節(jié)金屬磨損研究論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀(guān)點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢(xún)客服老師，歡迎參考。

【摘要】設(shè)計(jì)一種體外制備、分離人工關(guān)節(jié)金屬磨損顆粒的方法，并驗(yàn)證這種顆粒用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的可行性。［方法］用鈦鋁釩合金、鈷鉻鉬合金材料分別制成球磨罐(國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)枺?3142073.7),球磨罐內(nèi)裝有用同種材料制成的磨塊;向該球磨罐內(nèi)注入模擬生物體液;震動(dòng)球磨得到顆粒混懸液。梯度離心獲得金屬顆粒。對(duì)顆粒進(jìn)行：(1)元素成分鑒定；(2)顆粒大小鑒定和粒度分析；(3)掃描電鏡對(duì)顆粒的表面形態(tài)觀(guān)察；(4)將顆粒與J774A.1巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀(guān)察細(xì)胞吞噬顆粒的情況。［結(jié)果］通過(guò)此方法成功產(chǎn)生并分離出大量直徑1μm左右的鈦合金和鈷鉻鉬合金顆粒。(1)元素分析證實(shí)整個(gè)處理過(guò)程中無(wú)雜質(zhì)成分污染；(2)鈦合金顆粒的平均直徑Dv90∶1.009，鈷鉻鉬顆粒的平均直徑Dv90∶1.008，粒度分布曲線(xiàn)基本成正態(tài)；(3)掃描電鏡圖象顯示顆粒大小均勻，形狀多為不規(guī)則，與體內(nèi)顆粒極為相似；(4)J774A.1巨噬細(xì)胞能完整吞噬2種材料的顆粒。［結(jié)論］此方法能持續(xù)大量產(chǎn)生人工關(guān)節(jié)假體金屬材料的磨損顆粒，產(chǎn)生的顆粒能在各方面很好地模擬體內(nèi)磨損顆粒，為今后人工關(guān)節(jié)假體松動(dòng)相關(guān)研究的體內(nèi)、體外研究提供可靠的顆粒來(lái)源。

【關(guān)鍵詞】人工關(guān)節(jié)生物相容性材料磨損顆粒體內(nèi)研究體外研究

Abstract：［Objective］Todesignamethodofinvitropreparationandseperationformetallicwearparticlesaroundjointprosthesisandevaluateitsfeasibilityinmedicalexperiments.［Method］Ti-6Al-4VandCo-Gr-Moalloyswereusedtomaketwofrictionjarsrespectirely.Nationalinventivepatentappliednumber03142073.7.Lotsofquadrateblocksmadeofthesamematerialsareputintothejarsrespectively,whichwerethen.lubricatedbymanmadebodyfluidandvibratedonabottleshaker.After21daysthefluidwasharvestedandcentrifugedtogettheproducedwearparticles.Thecollectedparticleswerestudiedbyusingelementtraceanalysis,lasercountersizerandscanningelectronmicroscopy.TheJ774.A1macrophagesculturedtogetherwiththeseparticlesfor24hourswereobservedunderinvertedphasecontrastmicroscopyandtransmissionelectronmicroscopy.［Result］Agotgreatamountsofmetallicparticleswith1μmdiameterconedbeproduceusingthismethod.Theaveragediameteroftitaniumalloys(Dv90)is1.011andthatofCoGrMois1.010.Particlesizedistributionhadgoodconsistencyindifferentmaterials.Underscanningelectronmicroscopy,theparticleshadirregularshapesjustlikethosegotfromrevisionoperations.TheparticlestakenintotheJ774.A1macrophagescouldbeseenunderinvertedphasecontrastmicroscopyandtransmissionelectronmicroscopy.［Conclusion］Thismethodisgoodenoughtoproducllotsofmetallicwearparticlesmosthlikethosearoundtotaljointprosthesisandcanbeusedinfurtherinvivoandinvitrostudiesaboutjointprosthesisloosening.

Keywords：artifitialjoint;biomechanicalreceptivematerial;wearparticle;invivo;invitro

人工關(guān)節(jié)假體晚期松動(dòng)是長(zhǎng)期困擾骨科領(lǐng)域的難題。長(zhǎng)期的研究形成共識(shí)：假體材料磨損顆粒引發(fā)的由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞性骨吸收是假體松動(dòng)的主要生物學(xué)原因［1］。隨著各種新型生物金屬材料的不斷產(chǎn)生和人們對(duì)金屬-金屬人工關(guān)節(jié)假體的重新評(píng)價(jià)，細(xì)小金屬顆粒在假體松動(dòng)中的作用又成為了研究的熱點(diǎn)［2，3］。為解決人工關(guān)節(jié)松動(dòng)相關(guān)研究中顆粒來(lái)源匱乏的問(wèn)題，本研究在參考Rogers［4］方法的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出一種體外產(chǎn)生生物金屬材料細(xì)小磨損顆粒的方法，采用此方法成功制成了直徑1μm的鈦合金和鈷鉻鉬合金顆粒。并對(duì)顆粒的成份、大小、形態(tài)和粒度分布進(jìn)行分析觀(guān)察。顆粒與巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)中觀(guān)察吞噬的方法初步驗(yàn)證顆粒用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的可行性。

1材料與方法

1.1顆粒制備裝置的研制

原料選用醫(yī)用鈦鋁釩合金（上海思愛(ài)高科技開(kāi)發(fā)有限公司提供）和鈷鉻鉬合金（北京力達(dá)康科技有限公司提供）。采用非焊接技術(shù)制成3個(gè)中空的橢球形球磨罐（100mm×70mm×70mm）和立方形磨塊若干（5mm×5mm×5mm）。頂部開(kāi)口處采用螺紋旋入式頂蓋，加用聚乙烯的墊圈，以提高系統(tǒng)的密封性能，在設(shè)計(jì)上確保聚乙烯墊圈不外露于容器的內(nèi)壁，以防止混入聚乙烯磨損顆粒。底部支架使磨罐能在平面放置（圖1、2）。本裝置的所有組件按ASTMF86-76標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行清洗，75%酒精浸泡，高溫滅菌（121℃、15min）后備用。

生物金屬顆粒產(chǎn)生裝置及分離保存方法已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利。

發(fā)明名稱(chēng)：一種生物金屬材料超細(xì)粉末的制備方法及其制備裝置。

專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?3142073.7

1.2磨損顆粒的制備、離心分離與保存

無(wú)菌條件下打開(kāi)頂蓋，將磨塊放入球磨罐中，加入事先配制好模擬生物體液（PBS2%小牛血清5IU/ml青霉素5μg/ml鏈霉素）75ml作為潤(rùn)滑液。裝置至于搖床上，搖晃72h，棄掉潤(rùn)滑液，重新加入潤(rùn)滑液75ml，搖晃21d。收集潤(rùn)滑液與磨損顆粒的混懸液，加潤(rùn)滑液至80ml待用。

將鈷鉻鉬合金混懸液80ml分裝在8個(gè)10ml的試管中，500r/min離心2min，棄沉淀物，重新加潤(rùn)滑液至10ml，重復(fù)2次。1000r/min離心5min，棄上清，重新加潤(rùn)滑液至10ml,重復(fù)1000r/min離心5min1次，加潤(rùn)滑液至4ml,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

將鈦合金混懸液80ml分裝在8個(gè)10ml的試管中，500r/min離心4min，棄沉淀物，重新加潤(rùn)滑液至10ml，重復(fù)2次。1000r/min離心40min，棄上清，重新加潤(rùn)滑液至10ml,重復(fù)1000r/min離心40min一次，加潤(rùn)滑液至4ml,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3磨損顆粒成分元素分析

隨機(jī)抽樣選取鈦鋁釩合金原料和磨損顆粒樣品各一份進(jìn)行元素分析。秤取0.1g原料和磨損顆粒樣品，于聚四氟乙烯燒杯中，加入10mlHF（分析純），加熱1h，加入10mlH2SO4(GR),加熱1h，定容于500ml容量瓶中。取液進(jìn)入等離子體發(fā)射光譜儀（IRISAdvantage1000美國(guó)），儀器自動(dòng)讀出樣品元素組成。

1.4磨損顆粒的粒度分析

用潤(rùn)滑液（PBS2%小牛血清5IU/ml青霉素5μg/ml鏈霉素）進(jìn)入激光粒度儀（TSL100上海理工大學(xué)研制）校準(zhǔn)調(diào)零。取顆?；鞈乙?ml,在旋渦混合器上充分混勻，進(jìn)入激光粒度儀，計(jì)算機(jī)自動(dòng)顆粒濃度、粒度數(shù)據(jù)和粒度分布曲線(xiàn)。

1.5磨損顆粒的掃描電鏡觀(guān)察

取顆?；鞈乙?0ml，滴加到孔徑為0.22μm的濾膜上，烘干48h后表面真空離子噴金，掃描電子顯微鏡（QUANTA200荷蘭）進(jìn)行觀(guān)察并攝取圖像。

1.6巨噬細(xì)胞培養(yǎng)與吞噬實(shí)驗(yàn)

J774A.1巨噬細(xì)胞株來(lái)源于BALB/c小鼠網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤，由AmericanTypeCultureCollectionCo.（Rockville,MD,USA）提供，培養(yǎng)在含10%小牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和2%谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以2×105/ml接種于6孔板中，培養(yǎng)4～6h后，加入體外制備的鈷鉻鉬合金顆?；鞈乙海?07個(gè)/孔），另外于35mm培養(yǎng)皿中按上述方法接種細(xì)胞，刺激24h后用2.5%戊二醛溶液固定，進(jìn)行倒置相差顯微鏡觀(guān)察。同時(shí)設(shè)置不加任何刺激物的對(duì)照孔。

1.7巨噬細(xì)胞透射電鏡觀(guān)察

J774A.1巨噬細(xì)胞分別加入鈷鉻鉬合金顆粒混懸液和鈦鋁釩合金顆?；鞈乙海?07個(gè)/孔），作用24h后用2.5%戊二醛溶液固定。用橡皮刮子將全部細(xì)胞從皿底輕輕刮下，收集在離心管中離心2000r/min20min，棄上清，將沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊取出，用棉花紙包裹起來(lái)，然后進(jìn)行漂洗、1%鋨酸后固定15min、漂洗、脫水、浸透，將樣品從棉花紙內(nèi)取出進(jìn)行包埋，60℃烘箱內(nèi)48h，超薄切片，透射電鏡（HITACHIH-500日本）觀(guān)察并攝像。

2結(jié)果

2.1磨損顆粒成分元素分析

分析結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)中獲得的鈦鋁釩合金顆粒的元素構(gòu)成與其原料基本相同（表1），證實(shí)磨損顆粒的產(chǎn)生過(guò)程中無(wú)雜質(zhì)元素污染。表1鈦鋁釩合金磨損顆粒的元素分析結(jié)果

2.2磨損顆粒的粒度分析

鈦鋁釩顆粒的平均直徑Dv90∶1.009，99.93%的顆粒直徑在0.3～1.2μm之間；鈷鉻鉬顆粒的平均直徑Dv90∶1.008，99.93%的顆粒直徑在0.3～1.2μm之間；2種顆粒粒度分布曲線(xiàn)形態(tài)非常相似（圖3、4）。

2.3磨損顆粒的掃描電鏡觀(guān)察

鏡下可見(jiàn)體外制備的鈦鋁釩合金顆粒呈片狀、盤(pán)狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)則形狀，表面有低密度的血清蛋白沉積（圖5）。未見(jiàn)明顯的顆粒疊加和成團(tuán)聚集的情況。大小顆粒在濾膜上分布不均勻，大顆粒集中在邊緣上，小顆粒集中在中心部位。

體外制造的鈷鉻鉬合金顆粒也有片狀、盤(pán)狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)則形狀，鈷鉻鉬合金顆粒更多為塊狀顆粒，是由于顆粒輕度聚集，顯得體積更大（圖6）。

與體內(nèi)分離顆粒對(duì)照發(fā)現(xiàn)，顆粒的形態(tài)均非常近似，表面都有蛋白沉積。體內(nèi)分離顆粒大小分布更加不均勻（圖7）。

2.4巨噬細(xì)胞培養(yǎng)與吞噬實(shí)驗(yàn)

J774A.1巨噬細(xì)胞經(jīng)合適的條件培養(yǎng)24h后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，吞噬活性較強(qiáng)。倒置相差顯微鏡下細(xì)胞成圓形或橢圓形，細(xì)胞輪廓清晰，胞漿內(nèi)無(wú)明顯吞噬小體（圖8）。與體外制備的鈷鉻鉬顆粒共同培養(yǎng)24h后，鏡下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。細(xì)胞密度減小，細(xì)胞腫脹成圓形，胞核變大，甚至見(jiàn)到細(xì)胞大片壞死，核溶解，細(xì)胞碎裂，胞漿內(nèi)有被吞噬的鈷鉻鉬顆粒影像（圖9）。

2.5培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞透射電鏡觀(guān)察

當(dāng)金屬顆粒接近J774A.1巨噬細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞伸出偽足逐漸將較小的顆粒吞噬入細(xì)胞內(nèi)。此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始張大，胞漿內(nèi)線(xiàn)粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，表示分泌活動(dòng)活躍，顆粒進(jìn)入細(xì)胞成為吞噬體。胞漿密度變得不均勻，有空泡樣變（圖10）。

3討論

為闡明假體松動(dòng)的機(jī)理和對(duì)新型假體材料的生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)，眾多學(xué)者采用體外細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、體內(nèi)植入等方法對(duì)顆粒引發(fā)的生物學(xué)反應(yīng)進(jìn)行研究［5～7］。由于體內(nèi)顆粒來(lái)源有限，國(guó)內(nèi)學(xué)者常采用簡(jiǎn)單的材料對(duì)磨、過(guò)篩或接受?chē)?guó)外贈(zèng)送的方法體外獲得顆粒，而國(guó)外學(xué)者采用的方法有對(duì)磨（milling）、金屬熔體霧化（aerosolization）、氣化（gasatomization）、激光制粉法等［4］。由于來(lái)源雜亂，顆粒的各項(xiàng)特性變異較大，使大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)因無(wú)法重復(fù)和比較而失去實(shí)際意義。如何體外產(chǎn)生生物金屬的顆粒并使之能很好地模擬體內(nèi)顆粒是一個(gè)普遍地急需解決的問(wèn)題。

大量的研究已經(jīng)顯示：磨損顆粒的物理、化學(xué)性質(zhì)是影響機(jī)體反應(yīng)程度和假體松動(dòng)的關(guān)鍵因素。這些性質(zhì)包括：顆粒數(shù)量、大小、粒度分布、表面積、化學(xué)元素構(gòu)成、表面形態(tài)、可溶性金屬離子釋放、表面電荷等［5］。使體外生成的顆粒最大限度地模擬體內(nèi)磨損顆粒是作者設(shè)計(jì)這個(gè)方法時(shí)始終堅(jiān)持的原則。

3.1顆粒的產(chǎn)生方法

人工關(guān)節(jié)周?chē)慕饘倌p顆粒可以來(lái)源于關(guān)節(jié)面、柄-骨界面、假體-骨水泥界面、臼杯-骨界面、組合式假體的柄-頭結(jié)合處。從磨損機(jī)理上講屬于表面摩擦磨損，因此借鑒工業(yè)球磨的方法產(chǎn)生顆粒是合理的。作者自行設(shè)計(jì)的球磨罐具有以下特點(diǎn)：(1)采用相同的材料加工球磨罐和磨塊，無(wú)焊接工藝和罐口的密封裝置避免了任何其它材料參與摩擦，保證了顆粒的純凈；(2)潤(rùn)滑液采用PBS2%小牛血清5IU/ml青霉素5μg/ml鏈霉素，動(dòng)物血清對(duì)顆粒進(jìn)行預(yù)孵化(preincubation)，經(jīng)蛋白孵化的顆粒的生物學(xué)行為更接近體內(nèi)顆粒。在實(shí)踐中作者發(fā)現(xiàn)，預(yù)孵化過(guò)程能在顆粒表面形成蛋白保護(hù)膜，明顯減少顆粒的聚集成團(tuán)現(xiàn)象，有利于顆粒的離心分離和電鏡觀(guān)察；(3)本裝置的所有組件按ASTMF86-76標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行清洗，75%酒精浸泡，高溫滅菌，無(wú)菌操作過(guò)程和含抗生素的潤(rùn)滑液都保證了顆粒無(wú)微生物和內(nèi)毒素污染，這對(duì)于體內(nèi)和體外醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)是非常重要的；(4)低能量緩慢搖晃和潤(rùn)滑液的加入，使磨塊與罐壁、磨塊與磨塊之間進(jìn)行緩慢的摩擦，產(chǎn)生細(xì)小的顆粒，篩選效率提高。

3.2顆粒的分離方法

本實(shí)驗(yàn)采用“梯度離心”的方法對(duì)顆粒進(jìn)行篩選。其原理來(lái)自于Stokes''''法則：

R2=9ηh/(2t［ρ-ρ0］ω2n)

R：顆粒半徑η：潤(rùn)滑液黏滯度h：樣品高度t：離心時(shí)間ρ：金屬密度ρ0：潤(rùn)滑液密度ω：離心角速度n：樣品與旋轉(zhuǎn)軸距離

本實(shí)驗(yàn)中的常規(guī)變量只有ω和t，因此公式簡(jiǎn)化為：

RCo2=4.5×106/t(min)×ω2(r/min)

RTi2=9.0×106/t(min)×ω2(r/min)

RCo：鈷鉻鉬合金顆粒半徑RTi：鈦合金顆粒半徑t：離心時(shí)間ω：離心角速度

總之，本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，設(shè)備要求不高，利于應(yīng)用和推廣。

3.3顆粒的粒度測(cè)定方法

傳統(tǒng)的顆粒測(cè)定方法是在光鏡或電鏡下對(duì)顆粒進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，工作量大、精確度差。激光粒度儀利用測(cè)定激光束穿透顆?；鞈乙旱纳⑸涔烙?jì)出顆粒的平均體積，如假設(shè)顆粒為標(biāo)準(zhǔn)球體，則可計(jì)算出顆粒直徑。在應(yīng)用中作者認(rèn)為粒度儀用于人工關(guān)節(jié)顆粒分析的優(yōu)勢(shì)在于：測(cè)量速度快、誤差小、可定量分析、操作簡(jiǎn)單，非常適合大量樣本的檢測(cè)與對(duì)比研究。激光粒度儀是確定顆粒大小的有效方法，但在應(yīng)用中仍需注意：(1)激光粒度儀是在忽略顆粒形狀差異的基礎(chǔ)上對(duì)顆粒大小的計(jì)算和估計(jì)，所以顆粒形狀對(duì)于結(jié)果有影響。光鏡或電鏡下對(duì)顆粒進(jìn)行直接計(jì)數(shù)的方法可以彌補(bǔ)上述不足，并可以獲得顆粒形態(tài)的直觀(guān)資料，兩者可以取長(zhǎng)補(bǔ)短；(2)由于金屬顆粒的密度大，在液體中沉降迅速，也給結(jié)果帶來(lái)偏差。所以注意分離好的顆?；鞈乙阂M快進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定前再次震蕩混勻，有條件時(shí)可以選取甘油等高黏度懸浮液。

3.4發(fā)展方向展望

隨著各種新型生物金屬材料的不斷產(chǎn)生和人們對(duì)金屬-金屬和陶瓷-陶瓷人工關(guān)節(jié)假體的重新評(píng)價(jià)，細(xì)小金屬和陶瓷顆粒在假體松動(dòng)中的作用又成為了研究的熱點(diǎn)［2，3］。為適應(yīng)這一研究發(fā)展的需要，作者正在研究能產(chǎn)生更加細(xì)小金屬和陶瓷顆粒（直徑25nm左右）的方法。

圖1鈦鋁釩合金球磨罐和磨塊圖2鈷鉻鉬合金球磨罐和磨塊圖3鈦鋁釩顆粒平均直徑Dv90∶1.009，99.93%的顆粒直徑在0.3～1.2μm之間圖4鈷鉻鉬顆粒平均直徑Dv90∶1.008，99.93%的顆粒直徑在0.3～1.2μm之間圖5體外人工制造的鈦鋁釩合金顆粒掃描電鏡顯示：顆粒呈片狀、盤(pán)狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)則形狀，表面有低密度的血清蛋白沉積（2000×）圖6體外制備鈷鉻鉬合金顆粒掃描電鏡，鉻鉬合金顆粒更多為塊狀顆粒，是由于顆粒輕度聚集，顯得體積更大（2000×）圖7體內(nèi)分離與體外制備的鈦鋁釩顆粒掃描電鏡比較圖7aR為體內(nèi)分離顆粒圖7b為體外制備顆粒。顆粒的形態(tài)均非常近似，表面都有血清蛋白的沉積膜，體內(nèi)分離顆粒大小分布更加不均勻（R1000×，L2000×）圖8作為空白對(duì)照組的J774A.1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24h后的形態(tài)，細(xì)胞成圓形或橢圓形，細(xì)胞輪廓清晰，胞漿內(nèi)無(wú)明顯吞噬小體（200×）圖9J774A.1巨噬細(xì)胞與鈷鉻鉬顆粒共同培養(yǎng)24h后的形態(tài)改變，細(xì)胞密度減小，細(xì)胞腫脹成圓形，胞核變大，甚至見(jiàn)到細(xì)胞大片壞死，核溶解，細(xì)胞碎裂，胞漿內(nèi)有被吞噬的顆粒影像↑（200×）圖10J774A.1巨噬細(xì)胞內(nèi)的金屬顆粒，胞漿內(nèi)線(xiàn)粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，顆粒進(jìn)入細(xì)胞成為吞噬體，↑為金屬顆粒。胞漿密度變得不均勻（3500×）

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