導(dǎo)語(yǔ)：軟骨復(fù)合研究論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢(xún)客服老師，歡迎參考。

【摘要】探討軟骨組織工程方法修復(fù)骨軟骨缺損理想的種子細(xì)胞和支架材料。［方法］體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化，分別與PLGA支架復(fù)合培養(yǎng)，并模仿馬賽克骨軟骨移植術(shù)在犬關(guān)節(jié)骨軟骨缺損深層置入MSC－支架復(fù)合體，淺層置入誘導(dǎo)培養(yǎng)后的MSC－支架復(fù)合體，緊密壓配，體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，觀察其修復(fù)的情況。［結(jié)果］16周實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)完全由透明軟骨修復(fù)，與周?chē)＼浌峭耆诤?，組織觀察顯示以軟骨細(xì)胞修復(fù)為主，軟骨下骨形成，潮線基本恢復(fù)；陰性對(duì)照組缺損區(qū)主要由纖維組織修復(fù)，部分由透明軟骨修復(fù)，組織觀察顯示以纖維細(xì)胞修復(fù)為主，混有部分軟骨細(xì)胞；空白對(duì)照組完全由纖維組織修復(fù)。［結(jié)論］MSCs經(jīng)向軟骨細(xì)胞定向分化后復(fù)合PLGA支架材料，通過(guò)緊密壓配方式與MSCs－PLGA支架在體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，可以有效修復(fù)骨軟骨缺損。

【關(guān)鍵詞】骨髓基質(zhì)干細(xì)胞馬賽克移植術(shù)骨軟骨復(fù)合體骨軟骨缺損

Abstract：［Objective］Toevaluatetheeffectoftreatingtheosteochondraldefectswithimplantedcellscaffoldcomposites,culturedMSCsasseedcellsandPLGAasscaffolds,andtoacquiredesirableseedcellsandscaffoldmaterials.［Method］BMSCswereinducedtodifferenciatiatedintochondrocytes,coculturedwithPLGAscaffoldrespectivelyinvitro,thenimplantedintoosteochondraldefectsoncaninemodelsbyusingtechniquesofmosaicplasty,inducedBMSCPLGAscaffoldcompositesinthetopofthedefectandBMSCPLGAscaffoldcompositesinthebottomofthedefect,osteochondralcompositeswereconstructedinvivo,andrepairwasobservedwithnakedeyesandhistology.［Result］At16weeksaftertransplantationthedefectsofexpeirmentalgroupwerecoveredwithsemitransparentsmoothwhitetissueandthemarginsbetweentherepairtissueandthesurroundingcartilagewerenotrecognized.Histologically,mostoftherepairtissuewasconsistedwithchondrocytes,maintainedtheirthicknesstothefulldepthoftheoriginaldefects.Thesubchondralbonewaswellremodeled.Thetidemarkwasobserved.Thedefectsofpositivecontrolgroupwerecoveredwithrepairtissues,andpartialwereconformedwithoriginalcartilage.Therepairtissuewaspartlyfilledwithchondrocytes.However,thedefectsofnegativecontrolgroupwererepairedwithsoftfibroustissueswithoutluster,andanobviousboundarybetweenreparativeandoriginalcartilagewasseen.［Conclusion］MSCsPLGAscaffoldcomposites,constructedintoosteochondralcompositesbysuppressingcloselyinvivo,aretheidealmaterialsforrepairingcartilagedefects.

Keywords：bonemesenchymalstemcells(MSCs);mosaicplasty;osteochondralcomposites;osteochondraldefect

關(guān)節(jié)軟骨損傷是骨科臨床的常見(jiàn)疾病，以往臨床使用的治療方法均難以達(dá)到理想的要求。組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為這一難題的解決提供了前所未有的機(jī)遇。本實(shí)驗(yàn)研究的目的是采用軟骨組織工程技術(shù)，體外分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）為種子細(xì)胞，經(jīng)軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)后，與聚羥基乙酸（polyglycolicacid，PLA）－聚乳酸（polylacticacid，PGA）共聚物(PLGA)支架材料復(fù)合培養(yǎng)，并模仿馬賽克骨軟骨移植術(shù)在犬膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損深層置入MSC－支架復(fù)合體，淺層置入誘導(dǎo)培養(yǎng)后的軟骨細(xì)胞－支架復(fù)合體，緊密壓配，體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，觀察其修復(fù)的情況。期望能夠找到軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞和支架材料。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1種子細(xì)胞10～12個(gè)月齡健康比格犬，無(wú)菌穿刺抽取髂骨骨髓7～8ml，Percoll分離法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。

1.1.2支架材料將PLGA支架(購(gòu)自山東醫(yī)療器械研究所)剪成1.0cm×1.0cm×0.2cm大小的方塊，放入12孔板內(nèi)，然后經(jīng)紫外線照射30min消毒，備用。

1.1.3受體動(dòng)物及分組10～12個(gè)月齡健康比格犬10只（購(gòu)自山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），體重在8～10kg。在每只犬的雙側(cè)膝關(guān)節(jié)分別制造3個(gè)骨軟骨缺損區(qū)，隨機(jī)分為3組。A組：實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨缺損內(nèi)深層植入MSCs復(fù)合PLGA支架材料，淺層植入經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞復(fù)合PLGA支架材料，緊密壓配；B組：陰性對(duì)照組，缺損內(nèi)僅植入MSCs復(fù)合PLGA支架材料；C組：陽(yáng)性對(duì)照組，缺損內(nèi)不植入任何材料。

1.1.4主要試劑一抗：兔抗人Ⅱ型膠原抗體，二抗:山羊抗兔IgG，DAB顯色試劑盒，以上均購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2方法

1.2.1MSCs向軟骨細(xì)胞定向分化P1傳代細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底時(shí)，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度，加入含TGFβ110ng/ml、10％胎牛血清的低糖DMEM溶液誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.2誘導(dǎo)MSCs的鑒定（1）糖胺聚糖（GAG）檢測(cè)（表1）。取傳代培養(yǎng)第二代MSCs（P2），實(shí)驗(yàn)組加入TGFβ1誘導(dǎo)培養(yǎng)，對(duì)照組用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)全層時(shí)，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，接種于96孔板每孔200μl，繼續(xù)加入含不同的培養(yǎng)液每孔200μl，每組5孔，培養(yǎng)第3d換液1次，第7d（誘導(dǎo)培養(yǎng)后第15d）時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以硫酸軟骨素為標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度計(jì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，阿利新藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GAG含量；（2）Ⅱ型膠原免疫組化按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，Ⅱ型膠原陽(yáng)性的細(xì)胞，胞漿著色呈黃色或棕黃色（表2）。表1細(xì)胞因子對(duì)MSCs分泌糖胺聚糖（GAG）的檢測(cè)表2Ⅱ型膠原免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）

1.2.3細(xì)胞－支架復(fù)合體的構(gòu)建及其體外培養(yǎng)將上述2種細(xì)胞懸液調(diào)整濃度后，滴加到PLGA支架上，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。繼續(xù)各用原培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)7～8d，備掃描電鏡檢查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2.4復(fù)合體移植10～12個(gè)月齡健康比格犬10只，靜脈麻醉成功后，術(shù)區(qū)準(zhǔn)備完畢后，取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口，顯露膝關(guān)節(jié)，在膝關(guān)節(jié)股骨滑車(chē)處，用手搖鉆制作一個(gè)直徑為5mm的圓柱形軟骨缺損區(qū)，深達(dá)軟骨下骨，平均深為5mm。按照分組情況，A組：軟骨缺損處先在深層植入未誘導(dǎo)分化組的MSCs－PLGA復(fù)合體，再在淺層植入誘導(dǎo)分化組的軟骨細(xì)胞－PLGA復(fù)合體，緊密壓配；B組：缺損處全層植入未誘導(dǎo)分化組的MSCs－PLGA復(fù)合體；C組：空白對(duì)照，只造成缺損不植入任何材料。嚴(yán)密縫合關(guān)節(jié)囊。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。

1.2.5大體觀察分別于術(shù)后12、16周取材，觀察缺損區(qū)軟骨生長(zhǎng)情況。

1.2.6組織學(xué)觀察

2結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞接種后1～3d可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁，呈短梭形。3d后出現(xiàn)細(xì)胞集落，7～8d廣泛集落形成。12～14d細(xì)胞形成單層。傳代細(xì)胞貼壁快，7～8d形成單層，細(xì)胞核大，胞漿內(nèi)顆粒多。加入細(xì)胞因子后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快，體積增大，胞體變圓，呈漩渦狀生長(zhǎng)；

2.2實(shí)驗(yàn)組

MTT吸光度值、培養(yǎng)上清液中的糖胺聚糖（GAG）含量和Ⅱ型膠原分泌均明顯高于對(duì)照組。Ⅱ型膠原免疫組化陽(yáng)性的MSCs胞漿染色為黃色或棕黃色(圖1、2)。

2.3電鏡觀察

掃描電鏡顯示PLGA支架呈不規(guī)則多孔狀，孔徑控制在200～300μm，孔徑率85%，孔壁厚度較均勻,為20～40μm。復(fù)合材料顯示MSCs細(xì)胞在PLGA支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以見(jiàn)到細(xì)胞分泌的基質(zhì)和細(xì)胞偽足的鉚固作用(圖3)，表明支架材料具有良好的細(xì)胞親和性。

2.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大體觀察。術(shù)后12周：A組新生組織表面平整、光滑，與周?chē)浌墙缇€模糊，端面顯示軟骨厚度與正常軟骨相近；B組修復(fù)高度較周?chē)浌撬较嘟?，但軟骨層厚度比A組明顯偏薄，無(wú)光澤，與周?chē)浌墙缇€尚清楚；C組部分接近正常修復(fù)高度，修復(fù)組織呈黃色，局部凹陷。術(shù)后16周，A組缺損修復(fù)區(qū)組織與周?chē)P(guān)節(jié)軟骨相整合，軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋，與周?chē)浌墙M織外形無(wú)差異(圖4)；B組缺損區(qū)修復(fù)組織與周?chē)浌遣糠终显谝黄?，光澤較差(圖4)；C組缺損處修復(fù)組織低凹新生組織軟，無(wú)光澤，與周?chē)浌墙M織區(qū)別明顯。

組織學(xué)觀察。術(shù)后12周：A組缺損區(qū)形成透明樣軟骨組織，比周?chē)＼浌瞧?，軟骨?xì)胞數(shù)量多，出現(xiàn)明顯的規(guī)律，表面層的軟骨細(xì)胞平行關(guān)節(jié)面排列，深層縱向排列，軟骨基質(zhì)染色較四周時(shí)淡，軟骨下骨豐富。B組邊緣區(qū)厚度與周?chē)＼浌墙咏?，軟骨?xì)胞排列不規(guī)則，與周?chē)浌墙Y(jié)合可，無(wú)明顯裂隙存在。近中央?yún)^(qū)仍以纖維組織修復(fù)為主，細(xì)胞數(shù)很少，局部有裂隙。C組表面為纖維組織，細(xì)胞成分較少。術(shù)后16周，A組缺損區(qū)軟骨厚度與正常軟骨組織接近，細(xì)胞排列出現(xiàn)明顯規(guī)律，表面層的軟骨細(xì)胞平行關(guān)節(jié)面排列，深層縱向排列，與透明軟骨組織相似，軟骨下骨形成，潮線基本恢復(fù)，與周?chē)＼浌沁B接較好(圖5)。B組軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，中央修復(fù)區(qū)大部分為纖維組織修復(fù)(圖6)。C組缺損區(qū)內(nèi)主要為纖維組織(圖7)。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，數(shù)值以±s表示，以P＜0.05表示差異有顯著性意義。表3關(guān)節(jié)軟骨缺損的組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表4各組軟骨修復(fù)組織學(xué)評(píng)分結(jié)果各時(shí)間段A組與B組、C組比較均有顯著性差異，*P＜0.05。

3討論

有研究認(rèn)為對(duì)于微環(huán)境尚未受到嚴(yán)重破壞的組織修復(fù)或再生治療，不需要進(jìn)行體外誘導(dǎo)即可用干細(xì)胞直接移植修復(fù)，而對(duì)于缺損或微環(huán)境嚴(yán)重受損的組織修復(fù)或再生治療，則需要對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)后移植［1］。作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外對(duì)MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，(1)可以使細(xì)胞擴(kuò)增；(2)可以向軟骨細(xì)胞定向分化。在體外構(gòu)建成熟的組織工程化軟骨，是在模擬體內(nèi)微環(huán)境的條件，探索和研究軟骨種子細(xì)胞在支架內(nèi)黏附、增殖及種子細(xì)胞與支架材料的相容性即軟骨形成的條件、機(jī)制的問(wèn)題。作者把細(xì)胞－PLGA支架復(fù)合體在體外培養(yǎng)1周后，塑成圓柱狀，采用馬賽克移植方法植入缺損部位，底部為MSCsPLGA支架復(fù)合體，表層部分為誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCsPLGA支架復(fù)合體。在體內(nèi)微環(huán)境的作用下，迅速生成軟骨組織。在12周時(shí)，軟骨組織已充滿(mǎn)了整個(gè)缺損區(qū)，隨后深層軟骨組織逐漸被軟骨下骨替代。16周時(shí)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)分層排列，與周?chē)＝M織無(wú)明顯差別。在制造骨軟骨缺損模型的時(shí)候，損傷區(qū)會(huì)釋放生物活性因子，包括TGFβ、IGF1和BMP［2］。早期復(fù)合組織植入缺損部位后，在這些細(xì)胞因子的作用下，經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞在PLGA支架材料中迅速增殖，表層的復(fù)合體在關(guān)節(jié)內(nèi)滑液細(xì)胞因子和周?chē)浌墙M織微環(huán)境的作用下形成早期軟骨組織。而深部的復(fù)合體被來(lái)自于損傷區(qū)的血管組織侵入，機(jī)體的MSCs細(xì)胞和誘導(dǎo)植入的MSCs細(xì)胞，在局部微環(huán)境的作用下，形成骨組織－軟骨下骨，從而完成骨軟骨缺損組織的修復(fù)。這種修復(fù)的特點(diǎn)是軟骨與軟骨下骨形成堅(jiān)固的自然連接，軟骨下骨與軟骨同時(shí)獲得修復(fù)。但是作者某些切片中觀察到2種復(fù)合體之間有裂隙、整合差，但深部復(fù)合體與軟骨下骨的結(jié)合均良好。

盡管很多專(zhuān)家學(xué)者在體內(nèi)、體外均成功構(gòu)建出骨軟骨復(fù)合組織［3～7］,但是存在以下問(wèn)題:(1)無(wú)論在體外或體內(nèi),構(gòu)建組織的骨、軟骨界面結(jié)合欠佳；（2）植入軟骨與周?chē)拗鬈浌墙M織整合欠佳；(3)形成的軟骨組織質(zhì)量缺陷:透明軟骨比例少,缺乏正常關(guān)節(jié)軟骨的分層結(jié)構(gòu),缺乏表淺的扁平細(xì)胞層和潮標(biāo)等；（4）更為重要的是,以上構(gòu)建的骨軟骨復(fù)合組織只是短期觀察有證據(jù)初步表明在形態(tài)學(xué)、生化成分等方面具有骨軟骨組織結(jié)構(gòu),其生理功能、機(jī)械性能、能否長(zhǎng)期持續(xù)存在等尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。為了改善骨軟骨復(fù)合組織的結(jié)構(gòu)和界面形成情況,設(shè)計(jì)一體化、呈梯度變化的雙層支架材料將更為有利。Sherwood等［8］應(yīng)用TheriForm三維打印方法研制出一種新型的骨軟骨三維支架,在骨、軟骨端配件交界區(qū)組成成分含量、氣孔率等方面形成梯度變化,這樣可以避免支架在體外培養(yǎng)和體內(nèi)植入時(shí)發(fā)生界面分層而有利于新生的骨與軟骨組織之間形成良好界面。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：MSCs適合成為軟骨組織工程的種子細(xì)胞。取材方便，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定，易于傳代擴(kuò)增，在一定誘導(dǎo)條件的培養(yǎng)下，可以分化為軟骨細(xì)胞。TGFβ1在促進(jìn)MSCs細(xì)胞增殖和向軟骨細(xì)胞定向分化方面有顯著的作用。PLGA支架是理想的軟骨組織工程支架材料，具有良好的孔隙率和組織相容性，MSCs在其中可以很好地黏附、擴(kuò)展和增殖。MSCs經(jīng)向軟骨細(xì)胞定向分化后復(fù)合PLGA支架材料，通過(guò)緊密壓配方式與MSCs－PLGA支架在體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，可以有效修復(fù)骨軟骨缺損。

圖1對(duì)照組MSCs免疫組化結(jié)果陰性，胞漿內(nèi)未見(jiàn)到棕褐色顆粒圖2實(shí)驗(yàn)組MSCs免疫組化結(jié)果呈陽(yáng)性，胞漿內(nèi)見(jiàn)有棕黃色顆粒圖3細(xì)胞在支架材料上黏附、增殖，形成細(xì)胞團(tuán)，借偽足錨固于支架上圖4A組（黃箭頭）修復(fù)軟骨厚度較B組（綠箭頭）厚，與周?chē)M織邊界不清，需仔細(xì)辨認(rèn)（4個(gè)月后）圖5A組缺損區(qū)軟骨下骨結(jié)合緊密，潮線形成，與周?chē)浌墙M織融合好（4個(gè)月后×20）圖6B組缺損由纖維組織修復(fù)，細(xì)胞排列規(guī)律，與軟骨下骨結(jié)合尚可，局部有裂隙（4個(gè)月×10）圖7C組缺損部分纖維組織，排列雜亂，見(jiàn)分泌基質(zhì)。

【參考文獻(xiàn)】

［1］潘興華，韓毅冰，郭坤元，等.成體干細(xì)胞的分化潛能及在修復(fù)重建中的應(yīng)用前景［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2002，16（5）：329－332.

［2］WakitaniS,GotoT,PinedaSJ,etal.Mesenchymalcellbasedrepairoflarge,fullthicknessdefectsofarticularcartilage［J］.JBoneJointSurg(Am),1994，76(4):579－592.

［3］吳俊,孫俊英，李海燕，等.以PHBV為支架構(gòu)建組織工程化軟骨［J］．中國(guó)矯形外科雜志，2006，14（3）：1016-1018.

［4］曲彥隆，楊衛(wèi)良，孟祥文，等.梯度降解軟骨支架材料應(yīng)力刺激下與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合三維培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)矯形外科雜志，2006，14（10）：772-774.

［5］HungCT,LimaEG,MauckRL,etal.Anatomicallyshapedosteochondralconstructsforarticularcartilagerepair［J］.JBiomech,2003，36(12):1853-1864.

［6］MahmoudifarN,DoranPM.Tissueengineeringofhumancartilageandosteochondralcompositesusingrecirculationbioreactors［J］.Biomaterials，2005,26:7012-7024.

［7］MahmoudifarN,DoranPM.Tissueengineeringofhumancartilageinbioreactorsusingsingleandcompositecellseededscaffolds［J］.BiotechnolBioeng，2005，91(3)：338-355.

［8］SherwoodJK,RileySL,PalazzoloR,etal.Athreedemensionalosteochondralcompositescaffoldforarticularcartilagerepair［J］.Biomaterials,2002，23（24）:4739-4751.