導(dǎo)語(yǔ)：切除部分Ranvier 區(qū)對(duì)骺板軟骨細(xì)胞 bcl-2和ba表達(dá)的影響一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】bax

摘要:目的:探討凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2在Ranvier區(qū)部分切除后骺板軟骨組織中的表達(dá)。方法:切除12mm長(zhǎng)的新西蘭大耳白兔的脛骨近端Ranvier區(qū)，于術(shù)后1、4周處死實(shí)驗(yàn)兔，從免疫組化方面觀察凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2在Ranvier區(qū)部分切除后不同周齡的兔脛骨近端骺板軟骨組織中表達(dá)的變化特征。結(jié)果:隨著Ranvier區(qū)部分切除后，骨橋形成前骺板軟骨組織中的軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，骨橋形成后軟骨細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組。結(jié)論:Ranvier區(qū)和骨橋?qū)堪遘浌羌?xì)胞的凋亡率有促進(jìn)作用，骨橋的促進(jìn)作用更明顯。

關(guān)鍵詞:bax;bcl-2;Ranvier區(qū);骺板

累及Ranvier區(qū)的損傷常導(dǎo)致骺板橫向和縱向的發(fā)育紊亂［1］，也有可能導(dǎo)致骨軟骨瘤等骨腫瘤的發(fā)生［2］，Ranvier區(qū)在骨發(fā)育中的作用越來(lái)越受到重視。Ranvier區(qū)的損傷對(duì)骺板軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bax和bcl-2的表達(dá)是否有影響，目前仍然不清楚。因此，本研究利用切除Ranvier區(qū)后的骺板軟骨作為研究模型，試圖從骺板軟骨組織的整體上了解bax及bcl-2在切除Ranvier區(qū)后的骺板軟骨細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中的表達(dá)，探討bax及bcl-2在切除Ranvier區(qū)后骺板軟骨細(xì)胞凋亡中的分子生物學(xué)機(jī)理。

1材料與方法

1.1動(dòng)物模型制作

選用封閉群系日本大耳白兔24只，兔齡5周，體重0.5～0.7kg，隨機(jī)分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組12只。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組均采用一側(cè)脛骨近端骺板為實(shí)驗(yàn)部位，另一側(cè)作對(duì)照組。1%戊巴比妥鈉3ml/kg靜脈麻醉，手術(shù)野常規(guī)消毒，根據(jù)兔的解剖作各實(shí)驗(yàn)側(cè)膝前內(nèi)側(cè)直切口，長(zhǎng)約3cm切開(kāi)皮膚皮下組織，暴露脛骨結(jié)節(jié)以上脛骨體前內(nèi)側(cè)面。暴露干骺端骺板骨軟骨膜環(huán)，于骺板上方1.5mm至下方1.0mm處以小尖刀環(huán)形切除，厚約0.5mm、寬2～3mm、長(zhǎng)度為12mm骨軟骨膜。然后結(jié)扎止血，逐層縫合組織。對(duì)照組暴露干骺端骺板骨軟骨膜環(huán)后，不作切除，全層縫合組織。分別于術(shù)后1、4處死實(shí)驗(yàn)兔，每次每組處死6只。解剖出雙側(cè)脛骨。

1.2檢測(cè)方法及指標(biāo)項(xiàng)目

1.2.1組織學(xué)觀察新鮮標(biāo)本在10%中性甲醛溶液中固定1周，然后用10%EDTA室溫下脫鈣1月。冠狀面縱行剖開(kāi)，制作成4μm連續(xù)石蠟切片，HE染色染色。鏡下觀察骺板損傷后的病理改變。

1.2.2bcl-2和bax表達(dá)檢測(cè)方法bcl-2、bax單克隆抗體、SP試劑盒均為武漢博士德生物技術(shù)公司產(chǎn)品。采用SP免疫組化染色法，按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行。400倍顯微鏡下分別觀察bcl-2和bax蛋白的表達(dá)，并計(jì)算每10個(gè)隨機(jī)高倍鏡視野中陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)率。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1骺板損傷后的病理演變術(shù)后1周:RG切除區(qū)由開(kāi)始纖維化的肉芽組織覆蓋，骺板外側(cè)軟骨細(xì)胞增生帶明顯增厚。有薄層骨質(zhì)從二次骨化中心緊貼骺板外緣向下爬行至骺板外側(cè)軟骨細(xì)胞增生帶，肥大帶向下延長(zhǎng)，骺板呈向下彎曲現(xiàn)象（圖1A）。術(shù)后4周:RG切除區(qū)由纖維結(jié)締組織覆蓋，骺板外緣的骨質(zhì)明顯增厚，覆蓋整個(gè)骺板，骺板外側(cè)軟骨細(xì)胞較一周時(shí)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，并向下延續(xù)形成一條由增生、肥大及鈣化軟骨細(xì)胞組成的軟骨帶（圖1B）。

2.2bcl-2蛋白的表達(dá)結(jié)果bcl-2蛋白在細(xì)胞內(nèi)為胞漿表達(dá)，光鏡下呈現(xiàn)棕黃色顆粒，正常細(xì)胞表達(dá)程度較強(qiáng)而凋亡細(xì)胞表達(dá)程度較弱或不表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)1W切除組bcl-2蛋白表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量多，顏色深，呈強(qiáng)表達(dá)（圖2A）;對(duì)照組則表達(dá)細(xì)胞數(shù)少，且色澤淺，呈弱表達(dá)（圖2B）;1W切除組的陽(yáng)性表達(dá)率為41.53%，對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)率為32.46%，兩者的差異具有顯著性（χ2=14.32，P<0.05）。4W切除組的表達(dá)程度弱于對(duì)照組（圖2C，D）。

2.3bax蛋白的表達(dá)結(jié)果bax蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)部位及表達(dá)形態(tài)、色澤與bcl-2蛋白相同，但表達(dá)強(qiáng)度和意義有所區(qū)別，即正常細(xì)胞表達(dá)程度通常較弱或不表達(dá)而凋亡細(xì)胞表達(dá)程度較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)1W切除組細(xì)胞數(shù)表達(dá)且色澤淺，呈弱表達(dá)（圖3A）;對(duì)照組表達(dá)細(xì)胞數(shù)量多，顏色深，呈強(qiáng)表達(dá)（圖3B）。1W切除組的陽(yáng)性表達(dá)率為30.44%，對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)率29.02%，兩者的差異不具有顯著性（χ2=8.64，P>0.05）。4W切除組的表達(dá)程度強(qiáng)于對(duì)照組（圖3C，D）。表1兩組骺板軟骨bcl-2和bax的RNA表達(dá)陽(yáng)性率比較

3討論

早在1873年Ranvier曾描述了骨骺板周圍有一個(gè)環(huán)形切跡3］，該區(qū)包含三個(gè)不同的細(xì)胞群［4，最內(nèi)層有一組密集成團(tuán)的細(xì)胞，它們和骺生長(zhǎng)板增生層上部的軟骨細(xì)胞大約在同一水平，系胚胎的原始細(xì)胞演變成能生成骨皮的前骨母細(xì)胞，骨鈣素（BGP）免疫組化定位染色陽(yáng)性［5］，細(xì)胞核癌基因蛋白myc、jun免疫活性呈陽(yáng)性［6］，具有成骨特性及非?；钴S的增生、分裂和/或遷移的活性。該層細(xì)胞生成的骨皮除對(duì)骺板有機(jī)械支持作用外［7、8］，是否對(duì)骺板軟骨細(xì)胞的凋亡有影響，目前仍不清楚。與骺板軟骨細(xì)胞的凋亡有關(guān)的基因中，bcl-2是體內(nèi)細(xì)胞重要的抗凋亡基因之一［9］。bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，其高表達(dá)可阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，促進(jìn)細(xì)胞生存。bax是bcl-2的同源基因，其過(guò)度表達(dá)可拮抗bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于凋亡。在體內(nèi)bcl-2家族的成員通常以bcl-2/bax二聚體的形式發(fā)揮作用，兩者的比值決定了細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)敏感性。當(dāng)bcl-2/bax升高，表示細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)敏感性減弱，呈現(xiàn)抑制凋亡作用。兩者的比例決定細(xì)胞的生死，如bcl-2過(guò)量，形成bcl-2二聚體，那么細(xì)胞就存活;如bax過(guò)量，形成bax二聚體，細(xì)胞就會(huì)凋亡［10］。本實(shí)驗(yàn)首次觀察到，隨著Ranvier區(qū)部分切除后，凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax在骺板軟骨中的表達(dá)具有數(shù)量積累的趨勢(shì)。首先，骨橋形成前在靠近Ranvier區(qū)切除部分，骺板軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照側(cè)，bcl-2表達(dá)明顯增高而bax表達(dá)差異不具有顯著性，同時(shí)，骺板軟骨基質(zhì)表現(xiàn)出相應(yīng)的增生，同一骺板的Ranvier區(qū)相對(duì)未切除側(cè)骺板軟骨細(xì)胞凋亡率較對(duì)照側(cè)沒(méi)有明顯差異。說(shuō)明骺板軟骨細(xì)胞凋亡率的改變與局部細(xì)胞或炎性因子有關(guān)。其次，骨橋形成后軟骨細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照側(cè)，切除組較對(duì)照側(cè)bcl-2表達(dá)降低而bax表達(dá)增高，其軟骨細(xì)胞凋亡率明顯增高，說(shuō)明骨橋引發(fā)骺板軟骨細(xì)胞凋亡，引起bcl-2與bax表達(dá)改變。研究表明參與軟骨細(xì)胞的凋亡進(jìn)程的細(xì)胞因子中，目前研究較多的NO、PGE2、TNF-α、IL-l等炎性因子多抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡。僅甲狀旁腺激素相關(guān)肽（para-thyroidhormone-relatedpeptide，PTHrP）等既抑制軟骨細(xì)胞凋亡，又促進(jìn)軟骨基質(zhì)表現(xiàn)出相應(yīng)的增生，其作用最符合本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果。故認(rèn)為PTHrP在Ranvier區(qū)部分切除后，骺板軟骨細(xì)胞相應(yīng)的凋亡率變化中，具有重要意義。Amling等［11］的研究則顯示PTHrP可以上調(diào)bcl-2的表達(dá)，并指出這一作用可能是PTHrP抑制細(xì)胞分化和凋亡的機(jī)制所在。PTHrP選擇性抑制col-Ⅹ的合成，合成col-Ⅹ是軟骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志，提示PTHrP可抑制軟骨細(xì)胞成熟過(guò)程［12］。PTHrP又可顯著刺激軟骨基質(zhì)-蛋白多糖的合成［13］。PTHrP促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及合成軟骨基質(zhì)同時(shí)其分化成熟的機(jī)制尚未完全明確根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果，可以認(rèn)為Ranvier區(qū)內(nèi)層細(xì)胞生成的骨皮除對(duì)骺板有機(jī)械支持作用外，尚具有屏障作用，參與Ihh/PTHrP負(fù)反饋環(huán)路［14］，在骺板軟骨細(xì)胞增生層上部的水平上，阻斷PTHrP等細(xì)胞因子對(duì)軟骨細(xì)胞增殖及軟骨基質(zhì)合成的促進(jìn)作用，防止軟骨細(xì)胞過(guò)度增殖所致的軟骨發(fā)育不全，在保持骺板的生理發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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