導語：如何才能寫好一篇表白的話語，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

1、愿把我的心嵌入你的心，使我倆的愛永遠不變。

2、如果你是那河，我愿做河水里的小魚，時時游弋在你的懷中。如果你是月亮，我愿做一顆平淡的小星，點綴你的美麗。

3、想你想的睡不著覺，念你念的心怦怦直跳；戀你戀的鬼迷心竅，愛你愛的快要死掉！

4、在我絕望的時刻我真的不愿去想 我只想忘掉一切。

5、曾經(jīng)迷惘的心中，是你牽引我走出寂寞。

6、在每一個有你相伴的夜，不再過於寂寥冷清。

7、風輕云淡的美麗，是因為有你的存在，心與心的真誠，是因為你的信任，不論你在什么地方，你都是我唯一的眷念。

8、兩個人因為開心在一起叫喜歡，如果不開心還想在一起就是愛了。

9、我現(xiàn)在真的好想你，給你發(fā)信息可以緩解一下我對你的想念，可你現(xiàn)在好像很忙，覺得我很煩是嗎？打擾了！

10、個人的感情也是命中注定的，有時候沒什么可以多想的，該來的會來，該走的總會走，好好地愛自己，一個人最不能辜負的人就是自已，除了自已該做的，就好好對自已吧，不要有過高的要求，也許一切就會過得容易一些，自已也會快樂一些。

11、在我心中任何時刻都只有想你！愛你！

12、愿天上的每一個流星，都為你而閃耀天際。

13、我今天很不順利，看見漂亮女生微笑會讓我心情好一點，你可以為我笑一下嗎？不要虛擬的，可以嗎？

14、若有來世，我必踏遍千山萬水，去尋找那古老的唯一，尋找我永遠的愛人，你是我不變的最愛！

15、這輩子最瘋狂的事，就是愛上了你，最大的希望，就是有你陪我瘋一輩子。

16、讓我迷上你，迷上你的笑，迷上你的每一個動作，迷上你的每一個表情；你的心情就是我的心情——你高興，所以我高興，你憂愁，所以我憂愁。

17、情話綿綿：愿擁起落日余暉憑你采摘，愿留住剎那永恒讓愛來白。我愿變成一朵美麗的小花，常開在你目光注視的時間，飄香在你足跡踏過的地方。

18、淚水是我想你的滋味，我寄出的心無力挽回，如果回憶是唯一的回信，我不會忘記我曾經(jīng)美麗。

19、窗外雪花紛飛，我疑心是你的腳步，羞澀地抬起頭，窗外依舊，輕風、飛雪，又飄向記憶的深處，于是，我告訴你，我真地想你！

20、雨在下，風在刮，有人為你牽掛；有人哭，有人笑，()有人為你睡不著覺。

21、不是因為寂寞才想你，而是因為想你才寂寞。孤獨的感覺之所以如此之重，只是想你太深。

22、把滿腔柔情綻放為一株百合，讓縷縷馨香穿越遙遙時空，夜夜襲上你的額頭，拂去你所有的疲憊和失意。

23、看著微笑的你，突然發(fā)現(xiàn)，我真是世界上最幸福的人。

24、喜歡有你的一些信息，即使只是短短的問候，好讓我感覺到你沒有忘記我，心里還想著我，還有我的存在。

25、風一樣的是你的靚發(fā)，我是一片云依戀在你的身旁；水一樣的是你的嬌柔，我是一葉舟徘徊在你的暖鄉(xiāng)。

篇2

2、余生相擁。

3、永浴愛河。

4、念你如故。

5、與你共度。

6、白頭相守。

7、花前月下。

8、白頭偕老。

9、生死相伴。

篇3

【關鍵詞】 創(chuàng)傷弧菌； 金屬蛋白酶； 正交設計； 直觀分析； 方差分析

Abstract Objective: To optimize the expression of recombinant metalloprotease of Vvibrio vulnificus in E.coliBL21/DE3 induced by IPTG. Method: The plasmid of pET-32a-vvp/E.coliBL21 was constructed by our laboratory. Four different factors，including time， temperature， agitation speed and concentration of IPTG， were studied by orthogonal experimental design. The data were analyzed by direct calculation and ANOVA method. Results: The R value of agitation rate resulting from direct calculation was highest among four factors. The P value of agitation rate was lower than 0.05. The P value of the other factors were higher than 0.05. Conclusions: The expression level is remarkable affected by the agitation rate. The expression level of VVP protein is highest when agitation rate is 250 rpm. Therefore we have established a method for high-level expression of VVP-four hours-inducing time， 37℃-inducing temperature， 1mmol/L concentration of IPTG and agitation rate in 250rpm.

Key words vibrio vulnificus; metalloprotease; orthogonal experimental design; direct analysis; analysis of variance(ANOVA)

很多臨床病例及動物實驗已經(jīng)證明，進食被創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus，Vv）污染的食物或者皮膚破損接觸Vv均可引起Vv感染，主要表現(xiàn)為嚴重的蜂窩組織炎和敗血癥［1~3］。一旦出現(xiàn)敗血癥，其死亡率高達50%以上［4~6］。因其病情兇險，故對創(chuàng)傷弧菌感染的臨床早期快速診斷尤為重要。目前，Vv的致病機制尚未明了。但有研究表明該菌分泌的金屬蛋白酶（VVP）具有增加血管通透性，引起出血性損傷的作用，已被證實是創(chuàng)傷弧菌的主要毒力因素之一［7~9］，并且vvp基因在不同創(chuàng)傷弧菌菌株之間具有高度保守性。故金屬蛋白酶可作為創(chuàng)傷弧菌感染重要的臨床實驗室檢測靶標。而要制備以VVP為靶標的Vv免疫檢測試劑盒，首先必須獲得作為足量高純度的VVP抗原來制備抗體。但是金屬蛋白酶作為創(chuàng)傷弧菌種特征性的外毒素，其自然分泌產(chǎn)量并不高，且由于方法學的限制，采用常規(guī)生化方法獲得足量高純度溶細胞素相當困難。而通過基因工程的方法，我們可以在一個合適的系統(tǒng)中，使外源基因高效表達，從而生產(chǎn)有價值的蛋白質(zhì)，對其應用或進行功能的研究。但是外源基因在工程菌中的誘導表達受很多因素的影響，例如，誘導時間、誘導溫度、誘導劑濃度及搖菌的轉(zhuǎn)數(shù)等。因此，如何得到一種最佳的誘導條件組合，從而使蛋白高效穩(wěn)定的表達是我們研究的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

原核表達載體pET-32a-vvp由本課題組構(gòu)建；宿主菌E.coliBL21/DE3由南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院吳昆博士惠贈。

1.1.2 誘導劑IPTG和篩選用氨芐青霉素

購自鼎國生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計

針對誘導過程中對菌體表達蛋白產(chǎn)生影響的4個因素誘導時間、誘導溫度、誘導劑濃度以及誘導時搖菌的轉(zhuǎn)數(shù)，運用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件進行正交實驗設計。因素及水平見表1。表1 因素水平表（略）

1.2.2 誘導

質(zhì)粒pET-32a-vvp轉(zhuǎn)化E.coliBL21/DE3后，挑取單菌落接種于含氨卞青霉素(100mg/L)的LB培養(yǎng)基中，37℃活化過夜，次日按1:100的比例轉(zhuǎn)接，37℃培養(yǎng)至OD600約0.8時即根據(jù)不同誘導條件進行誘導，誘導條件見實驗設計。離心收集菌體，做SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色、脫色后觀察。掃描后運用圖像分析軟件Quantity One得出各不同誘導條件下融合蛋白VVP的表達濃度。

1.2.3 正交試驗直觀分析法

分別計算每個因素各水平下的平均收率，用各因素各個水平平均收率的極差R(極差=平均收率的最大值- 平均收率的最小值)來反映各因素的水平變動時對試驗結(jié)果影響的大?。?0］。

1.2.4 方差分析

運用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件對正交設計資料進行分析。

1.2.5 結(jié)果驗證

在由上述方法得出的最佳誘導條件下，對轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pET-32a-vvp的E.coliBL21/DE3進行誘導，并對結(jié)果進行SDS-PAGE分析，以驗證此組合的誘導條件的誘導表達效果。并設置轉(zhuǎn)化空載體組及未誘導組進行對照。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE 結(jié)果

取16組經(jīng)不同誘導條件誘導的菌液作組間平行SDS-PAGE，經(jīng)Quantity One對染色凝膠做圖像分析，來確定融合蛋白VVP表達的相對比例。SDS-PAGE 結(jié)果見圖1，圖上方的數(shù)字代表組別。經(jīng)掃描得到各組VVP的表達比例見表2。

2.2 優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 正交試驗直觀分析法

運用正交試驗直觀分析法得出的條件優(yōu)化結(jié)果見表2和圖2，K1、K2、K3、K4分別表示每個因素各水平下的蛋白表達量的均值［10］。由極值R的大小推知，各因素的重要性依次為誘導搖菌轉(zhuǎn)數(shù)、誘導時間、誘導溫度、誘導劑IPTG濃度。本實驗的最佳搭配誘導條件為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250r/m、誘導時間4h、誘導溫度37℃、誘導劑IPTG濃度1mmol/L。表2 實驗設計與結(jié)果分析（略）

2.2.2 方差分析

運用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件對進行正交設計資料進行方差分析得出的條件優(yōu)化結(jié)果見表3。搖菌轉(zhuǎn)數(shù)的P值小于0.05，即該因素對試實驗結(jié)果影響顯著；而時間、溫度及IPTG濃度的P 值均大于0.05。表3 方差分析表（略）

2.2.2 結(jié)果的驗證

在誘導條件為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250r/m、誘導時間4h、誘導溫度37℃、誘導劑IPTG濃度1mmol/L的情況下，VVP的表達量達到了40.67%。而其它4組對照組均無表達，見圖3。

3 討論

正交試驗設計是一種安排多因素多水平試驗，并利用普通的統(tǒng)計分析方法來分析試驗結(jié)果的一種試驗設計方法［10］。對于多因素多水平的問題，通常都希望通過試驗找出因素的主次關系和最優(yōu)搭配條件。用正交設計合理地安排試驗，可以做到省時、省力、省錢，同時又能得到基本滿意的試驗效果［10］。因此在本研究中，我們運用這種實驗設計方法對融合蛋白VVP在工程菌中的誘導表達條件進行優(yōu)化，旨在獲得穩(wěn)定高效表達的VVP蛋白，從而為VVP的致病機理研究以及Vv免疫檢測試劑盒制備奠定基礎。

目的基因在大腸桿菌中的誘導培養(yǎng)方式主要有兩種，即化學物質(zhì)誘導和溫度誘導，pET32a載體帶有啟動子T7lac，可采用化學物質(zhì)IPTG進行化學誘導［11］。要實現(xiàn)蛋白產(chǎn)物的高表達，需要考慮重組菌生長和產(chǎn)物表達的最適環(huán)境條件，包括誘導時間、誘導溫度、搖菌的轉(zhuǎn)數(shù)及最適誘導劑濃度等。細菌在誘導后，大量能量會消耗在外源蛋白的表達上，使細菌的生長提前進入衰亡期，過度誘導會造成溶菌。因此需要對誘導時間進行控制，找到能使外源蛋白充分表達而又不會導致溶菌的適當誘導時間，我們在實驗中設計了3個連續(xù)的時間水平1h、2h、3h。在誘導溫度上，不同的蛋白對溫度有不同的要求。有研究表明，有些外源蛋白在低溫下才能大量表達［12］；而本實驗中的工程菌大腸桿菌的最適生長溫度是37℃。考慮到這兩方面的要求，我們在實驗中設計了3個溫度水平：20℃、30℃、37℃。搖菌的轉(zhuǎn)數(shù)對細菌的生長也是極為重要的。體系溶解氧是影響菌體代謝的重要參數(shù)，外源基因在高效轉(zhuǎn)錄和翻譯時需要大量能量，及時給予飽和需氧量對高效表達有意義［13］。加入誘導劑后通過改變攪拌轉(zhuǎn)數(shù)(r/min)來改變氧傳遞推動力和液相體積氧傳遞系數(shù)，以達到調(diào)節(jié)體系溶解氧的目的。通常攪拌轉(zhuǎn)數(shù)愈大液相體積氧傳遞系數(shù)愈大，但當r/min 很大時，體系產(chǎn)生不可避免的泡沫而阻止了氧的傳遞;同時r/min過大則產(chǎn)生較大的剪切力，亦對菌體生長不利［11］。我們在實驗中設計了3個r/min水平：100、180、250。誘導劑IPTG的濃度對外源蛋白的表達水平有較大影響，濃度過高會對宿主菌造成損害，過低則影響誘導劑的效用。因此實驗中設計了4個濃度水平:0.1mmom/L、0.5mmom/L、1mmom/L、2mmom/L。

本實驗設計的因素水平不等，因此在對正交設計資料進行直觀分析時，我們運用平均蛋白表達量K1、K2、K3值的大小來反映各因素的不同水平對實驗結(jié)果(蛋白表達量)影響的大小，并以此確定實驗的最佳搭配。用各因素各個水平蛋白平均表達量的極差R來反映各因素的水平變動時對實驗結(jié)果影響的大小。極差大的就表示該因素的水平變動時對實驗結(jié)果的影響大，極差小的就表示該因素的水平變動時對實驗結(jié)果的影響小。本實驗中，我們得到因素的主次順序為誘導搖菌轉(zhuǎn)數(shù)、誘導時間、誘導溫度、誘導劑IPTG濃度。主要因素應取較好的水平，而次要因素，則可根據(jù)對成本、時間、收益等方面的統(tǒng)籌考慮而選取適當?shù)乃健Ｕ辉囼灥闹庇^分析法簡便、直觀、計算量小，但不能估計試驗誤差，即不能區(qū)分是由于各因素的水平變化而導致試驗結(jié)果的差異，還是由于試驗的隨機波動而導致試驗結(jié)果的差異。為解決此問題，可對試驗結(jié)果做方差分析。由表3可知，搖菌轉(zhuǎn)數(shù)的P值小于0.05，而時間、溫度及IPTG濃度的P 值均大于0.05。按方差分析法的觀點，只須對有顯著意義的因素確定好水平，而其它對試驗結(jié)果沒有什么影響的因素，則可按實際需要來確定適當?shù)乃?。方差分析的結(jié)果與直觀分析方法得到的結(jié)果相同。并且這一結(jié)果也通過VVP的高表達(表達濃度達到了40.67％)得到了驗證。由此得本研究的試驗最佳組合為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250rpm、誘導時間4h、誘導溫度37℃、誘導劑IPTG濃度1mmol/L。

【參考文獻】

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11 pET系統(tǒng)操作手冊 Novagen.

篇4

【關鍵詞】 多藥耐藥相關蛋白質(zhì)類·抗藥性， 腫瘤·抗腫瘤聯(lián)合化學治療方案

耐藥蛋白是耐藥相關基因表達產(chǎn)物，主要包括P糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關蛋白（MDR-associated protein，MRP）、肺耐藥蛋白（lung resistance-related protein， LRP）、拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶π（GSTπ）等。多藥耐藥基因及其表達產(chǎn)物通過介導藥物外排，細胞內(nèi)解毒酶活性的改變等機制在腫瘤細胞多藥耐藥（multiple drug resistance，MDR）機制中發(fā)揮重要作用。

耐藥蛋白的表達具有差異性，耐藥蛋白表達特征是判斷惡性腫瘤化療敏感性的一個極重要的指標。早期明確耐藥蛋白在不同個體的腫瘤組織中的表達差異，是選擇適宜的個體化治療方案、避免化療失敗、提高患者生存率的重要環(huán)節(jié)。

1　耐藥蛋白在腫瘤組織中的表達

研究證實，目前已發(fā)現(xiàn)的耐藥蛋白在肝癌組織中均呈高表達狀態(tài)，在肝癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達往往呈現(xiàn)逐漸減低的梯度趨勢。Tsuda 等［1］研究結(jié)果表明P-gp在肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中的陽性表達率為53.6％，在癌旁組織中的表達率為33.9％，均高于正常肝組織。我中心的研究也顯示，MRP和LRP在肝硬化、癌旁肝組織及術前未化療的HCC組織中均有不同程度的表達，且HCC組織中表達的明顯高于肝硬化、癌旁肝組織［2-3］。TopoⅡ與GST-π均參與肝癌化療耐藥。研究報道，GST-π在肝癌組織中的陽性率為71.4%，TopoⅡ陽性率為31.4%，且門脈癌栓患者TopoⅡ的陽性表達率高于無門脈栓者（P

P-gp表達水平與肺癌耐藥性關系尚存在爭議。多數(shù)學者認為P-gp與肺癌多藥耐藥無關，也有學者認為二者間存在明顯的關系［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)LRP在肺癌組織中廣泛高水平表達，而在正常肺組織內(nèi)表達水平卻很低，形成很大的表達差異，從而使LRP成為肺癌化療中判別個體敏感度的理想指標［7］。MRP基因在肺癌組織中的表達水平較高，且在肺鱗癌中的陽性表達率明顯低于腺鱗癌和腺癌［8］。

P-gp是目前與胃癌化療敏感性關系最密切的耐藥因子之一，其表達與胃癌的組織學類型相關。P-gp和LRP在高、中分化腺癌中的表達要高于低分化腺癌，與臨床胃低分化腺癌化學治療效果較好相符合［9］。GST-π、TopoII在胃癌組織中的表達顯著高于其周圍正常黏膜組織［10-11］，提示二者均是參與胃癌化學治療耐藥的重要因子。

耐藥蛋白在乳腺癌組織中的表達水平普遍較高。Tsukamoto等［12］檢測了94例乳腺癌標本，發(fā)現(xiàn)P-gp陽性表達率為37. 2%；Lacave等［13］ 的研究結(jié)果顯示，MRP1在乳腺癌患者的表達率為94.6％；而 Izquierdo等［14］報道LRP在乳腺癌組織中表達率為83％。

GSTπ、P-gp和TopoⅡ的高表達與腫瘤轉(zhuǎn)移潛能、化學治療效果差、低緩解率、高復發(fā)率、生存期短等有關，可作為評價腫瘤患者預后的指標［15］；而LRP、MRP則可能與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關［16-17］。

2　耐藥蛋白的檢測

如何獲知腫瘤患者體內(nèi)耐藥蛋白的表達情況是關系到能否將耐藥蛋白研究應用于臨床的關鍵問題。針對不同類型的患者，采用不同的方法。

2.1　手術患者耐藥蛋白的測定　對于可以獲取腫瘤組織的臨床手術患者，檢測MDR基因的手段較多，主要是分子、蛋白質(zhì)和細胞三個水平。

分子水平方面主要是檢測MDR1 mRNA的表達水平。常用的方法包括：RT-PCR、原位雜交、Slot—blot（SB），Northern blot（NB）、Rnase保護實驗等。其中因RT-PCR操作簡便安全，特異性及敏感性高而在臨床應用較多，是目前檢測腫瘤多藥耐藥性的一種較理想的檢測方法。蛋白質(zhì)水平臨床上主要應用的是免疫組織化學法直接檢測組織中耐藥蛋白表達量。此外，流式細胞儀在監(jiān)測腫瘤細胞耐藥基因表達產(chǎn)物水平的應用日趨廣泛。細胞水平上可采用熒光染料如若丹明123或具有天然熒光的柔紅霉素與細胞共同培養(yǎng)，用熒光分光度計測定單個細胞內(nèi)藥物濃度，幫助判定細胞的耐藥程度。

了解手術患者耐藥基因表達檢測方法有多種，各具其優(yōu)缺點。對于高表達的P-gp，各種檢測方法所得的結(jié)果基本一致；對于低表達的P-gp，采用RT-PCR檢測所得的結(jié)果較可信。

2.2 非手術患者耐藥蛋白的測定

術后化學治療患者的耐藥蛋白的測定依賴于手術中腫瘤標本的獲取。對術前化學治療的患者以及不能、不需或不愿手術的患者，耐藥蛋白的檢測成為臨床亟待解決的問題。

研究發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)耐藥蛋白的表達，不僅局限于腫瘤原發(fā)灶，在與原發(fā)灶相關的淋巴結(jié)、轉(zhuǎn)移灶、癌栓中均有表達，且與原發(fā)灶中的表達具有極強的相關性與一致性。這一發(fā)現(xiàn)為臨床間接檢測耐藥蛋白的表達提供了新的思路與理論依據(jù)。楊盛力等［18］通過對比肝癌原發(fā)灶與門靜脈癌栓中的P-gp表達情況發(fā)現(xiàn)，肝癌原發(fā)灶中P-gp的平均吸光度為（0.247±0.060），癌栓中為（0.251±0.071），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義，認為可以通過檢測門靜脈癌栓中P-gp表達情況，間接預測未切除的原發(fā)灶及其他轉(zhuǎn)移灶對化學治療藥物的耐藥程度。侍作亮等［19］利用熒光定量聚合酶鏈式反應（FQ-PCR）檢測原發(fā)性肝癌外周血有核細胞與術后腫瘤標本中MDR1基因的表達，結(jié)果顯示外周血MDR1基因表達的結(jié)果與肝癌細胞MDR1的表達明顯相關，提示FQ-PCR可用于原發(fā)性肝癌病例多藥耐藥性的臨床檢測。徐敏等［20］研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間P-gp在蛋白水平表達差異無統(tǒng)計學意義，因而可以通過檢測乳腺癌患者淺表的轉(zhuǎn)移灶或轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中P-gp的表達，了解原發(fā)灶中P-gp的表達情況，指導臨床化學治療藥物的選擇。

3　腫瘤個體化化學治療方案的確定

3.1　化學治療藥物的合理選擇　要提高腫瘤的化學治療效果，藥物的選擇、配伍至關重要。了解腫瘤患者耐藥基因的表達情況，參照耐藥蛋白的耐藥譜（表1），可以預測腫瘤對化學治療藥物的反應程度，制定個性化的聯(lián)合化學治療方案。

3.2　多種藥物聯(lián)合化學治療　將作用于細胞不同增殖時相的藥物聯(lián)合使用，有助于提高腫瘤化學治療敏感性而增加療效。并且多種藥物聯(lián)合化學治療可避免單一藥物使用所導致的耐藥。

3.3　體外藥敏試驗　隨著體外抗腫瘤藥敏試驗技術的提高，體內(nèi)外藥敏結(jié)果符合率增加。根據(jù)體外藥敏試驗結(jié)果指導化學治療，可減少化學治療的盲目性，提高療效，避免耐藥。

3.4　合用化學治療逆轉(zhuǎn)劑　化學治療逆轉(zhuǎn)劑又稱化學治療增敏劑，是一類增加腫瘤細胞對化學治療藥物敏感性，逆轉(zhuǎn)耐藥性的藥物?；瘜W治療藥物與逆轉(zhuǎn)劑合用是臨床上解決耐藥問題的新途徑。

4　結(jié)語

耐藥蛋白在腫瘤組織中的個體差異性表達是臨床個體性化學治療的重要理論基礎之一，其理論研究及臨床實踐作用尚存在巨大的發(fā)展空間。一方面，對于耐藥基因差異性表達的分子機制及內(nèi)在聯(lián)系有待深入研究，特別是直接影響耐藥基因表達水平及對耐藥基因啟動因子調(diào)控起作用的轉(zhuǎn)錄因子、癌基因或抑癌基因（如P53）的研究，能夠進一步揭示耐藥基因差異性表達的實質(zhì)，為治療多藥耐藥腫瘤提供新的策略。另一方面，先進科學技術在臨床上的應用，可以大大提高個體耐藥蛋白表達的檢測水平。如近年來迅速發(fā)展的基因芯片技術，不僅克服了效率低、難以定量檢測的問題，還有助于新耐藥基因的發(fā)現(xiàn)。

參考文獻

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篇5

【關鍵詞】 老年； 急性髓系白血?。?阿柔比星； 阿糖胞苷； 粒細胞集落刺激因子； 柔紅霉素

中圖分類號 R733.73 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2014）16-0048-02

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia， AML）是很常見的一種白血病，有統(tǒng)計學顯示，AML約占白血病總發(fā)病人數(shù)的70%[1]。對其治療較經(jīng)典的化療方案為標準DA方案。但是對于老年患者而言，一般化療的療效并不顯著，且并發(fā)癥較多，較多患者根本無法耐受，這與老年患者身體一般情況和生理情況有著重要的關系[2]。提高療效并減少并發(fā)癥是老年AML患者治療的關鍵，如今預激方案備受關注。本文以筆者所在醫(yī)院63例AML患者為對象，比較分析預激方案與標準化療的療效和安全性?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2006年1月-2011年5月在筆者所在醫(yī)院進行治療的63例AML患者為觀察分析對象。63例患者入院時經(jīng)過骨髓細胞形態(tài)學檢查以及免疫組化檢查，并參照診斷標準[3]確診。男33例，女30例，患者年齡61～74歲，平均（69.7±5.2）歲。M1 3例，M2 11例，M4 18例，M5 26例，M6 5例。患者接受治療前明確治療的具體事宜及可能出現(xiàn)的不良反應，全面系統(tǒng)的檢查排除患者心、肝、肺、腎等重要臟器功能障礙。63例患者按照隨機數(shù)字表法分為治療組和對照組，治療組36例患者接受預激方案治療，具體為CAG預激方案（阿柔比星，阿糖胞苷，粒細胞集落刺激因子）；對照組27例患者采用標準DA方案（柔紅霉素，阿糖胞苷）治療。兩組患者年齡、性別等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

治療組患者接受CAG預激方案治療，具體為ACR 7 mg/m2靜脈滴注，第1～4天，1次/d；Ara-c總量為20 mg/d，于每12小時10 mg皮下注射，每天2次，第1～14天；G-CSF 200μg/（m2?d），為皮下注射，第1～14天。G-CSF首次運用在Ara-c運用的前一天，最后一次運用在Ara-c前半天。治療的全過程中應密切監(jiān)視患者的身體一般情況和不良反應，當血細胞的檢測示白細胞大于20×109/L時就應停用G-CSF。對照組患者接受DA標準化療方案，具體為DNR 45 mg/（m2?d）靜脈注射，第1～3天；Ara-c總量為20 mg/d，于每12小時10 mg皮下注射，每天2次，第1～7天。完成一個周期后按照療效評定標準評定，對未達到部分緩解的患者進行第2療程的治療，仍未達到部分緩解的停止該方案的治療。

1.3 療效評定標準

療效評定參照文獻標準，共分為緩解（CR）、良效（PR）和無效（NR）[3]。不良反應參照世界衛(wèi)生組織標準。生存情況分析以患者治療后隨訪進行客觀評價。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用字2檢驗，P

2 結(jié)果

治療組總有效率為80.56%，對照組為51.85%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=5.867，P=0.015

3 討論

隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，AML的治療能取得一定的療效。但是治療過程中出現(xiàn)較多和嚴重的不良反應使得患者不能耐受，這也是導致失敗的主要原因之一。特別是對于老年患者，由于其身體素質(zhì)一般較差，使得治療過程中難于耐受。諸多研究也證實，AM老年患者治療時身體一般情況較差，并且與預后不良相關因素較多，藥物的敏感性也較弱以及耐藥基因的高表達使得治療療效并不顯著[4-5]。因此尋求一種能提高療效并能使老年患者耐受的治療方案是研究和發(fā)展的重點。

以前的經(jīng)典治療方案為DA方案，其治療的緩解率在60%～80%，但是其不良反應對于老年患者來說難于耐受[6]。近年來研究和運用的預激方案對于老年患者的治療取得較為一致的認同。其主要作用機制為：G-CSF受體廣泛分布在AML細胞，這就使得S期細胞增多而使其他藥物對其毒性作用加強[7]。另外，G-CSF可促使Ara-c與細胞DNA結(jié)合，使得小劑量的Ara-c作用加強，相應不良反應也就降低，其具體機制目前研究還有很多[8]。通過上述機制，使得治療的療效有較大的提升。

DA標準化療對AML有一定的療效，但其對于老年患者而言不易耐受而使得治療失敗較多。預激方案的運用，不僅提高了治療的療效，相對而言還降低了不良反應率，對于老年AML患者的治療有諸多的好處，很大程度提高了治療的成功率，值得臨床借鑒運用。

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篇6

【關鍵詞】 腸上皮化生 CDX2 PTEN 胃腫瘤

【ABSTRACT】 Objective: To study the relationship of expression of CDX2 and PTEN proteins and gastric metaplasia. Methods: Immunohistochemistry Envision method was used to detect the expression of CDX2 and PTEN proteins in simple intestinal metaplasia (SIM)， atypical intestinal metaplasia (AIM) and gastric adenocarcinoma. Results: The positive rates of CDX2 in SIM， AIM and gastric adenocarcinoma was 82.6%， 51.5% and 36.4% respectively. The expression of CDX2 in gastric adenocarcinoma was significantly lower than that in SIM(P0.05). The positive rates of PTEN in SIM， AIM and gastric adenocarcinoma were 86.9％，75.8％and 47.7％ respectively and the difference between SIM and gastric adenocarcinoma was significant (P

【KEY WORDS】 Intestinal metaplasia·CDX2·PTEN·Stomach neoplasms

胃黏膜腸上皮化生（簡稱腸化）和胃癌的關系一直存在爭議，1955年Morson發(fā)現(xiàn)胃癌可以在腸化的胃黏膜處發(fā)生，提出腸化和胃癌有關［1］。但ECTOR等隨訪171例腸化患者8～9年，只有3例發(fā)生癌變［2］。CDX2是腸道特異性轉(zhuǎn)錄因子， 對腸上皮細胞的分化、增殖、凋亡和腸道特定基因的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。PTEN基因為具有磷酸酶活性抑癌基因，可以通過刺激CDX2啟動子轉(zhuǎn)錄活性增強CDX2的表達。張建平等［3］根據(jù)上皮細胞形態(tài)及上皮結(jié)構(gòu)將腸化分為兩型：單純腸化 （simple intestinal metaplasia，SIM）和不典型腸化（atypical intestinal metaplasia，AIM），本研究應用免疫組織化學方法檢測胃黏膜腸化和胃癌組織中CDX2與PTEN蛋白的表達，探討腸化與胃癌的關系。

1　資料與方法

1.1　一般資料　收集2005年1月—2006年12月山東大學齊魯醫(yī)院普外科收治胃黏膜腸化患者100例。其中SIM 23例，男16例，女7例，年齡32～73歲，平均年齡49.4歲；AIM 33例，男22例，女11例，年齡34～70歲，平均年齡53.2歲；胃癌44例（其中腸型胃癌26例，彌漫型胃癌18例），男30例，女14例，年齡32～77歲，平均年齡55.5歲。

1.2　方法　單克隆抗體CDX2與PTEN（即用型）及PV9000檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。取所有患者胃鏡活組織檢查或手術切除的組織標本蠟塊行4 μm 連續(xù)切片，作HE和免疫組織化學染色。免疫組織化學染色采用EnVision法［4］；CDX2蛋白陽性染色表現(xiàn)為細胞核或細胞質(zhì)出現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒，PTEN蛋白陽性染色表現(xiàn)為細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.3　統(tǒng)計學處理　采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。不同胃黏膜病變組織中CDX2與PTEN陽性率的比較采用χ2檢驗， P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1　胃黏膜病變組織形態(tài)學觀察　SIM組織由柱狀細胞和杯狀細胞組成，杯狀細胞及腺體形態(tài)規(guī)則，上皮無假復層改變；AIM組織杯狀細胞常呈扁卵圓形，極性紊亂，核仁明顯，上皮細胞可呈假復層，細胞核泡沫狀呈腺瘤樣豎起，胃小凹呈鋸齒狀（表1，圖1）。

2.2　胃黏膜病變組織中CDX2蛋白的表達　5例SIM組織和6例AIM組織細胞質(zhì)CDX2陽性染色，其他為細胞核陽性染色，未發(fā)現(xiàn)細胞核與細胞質(zhì)同時染色病例；CDX2蛋白在SIM組織的陽性表達率82.6%（19/23），在AIM組織中的陽性表達率為51.5%（17/33），在胃癌組織中的陽性表達率為36.4%（16/44），其中12例為腸型胃癌，4例為彌漫性胃癌；SIM組織中CDX2的表達顯著高于AIM組織（χ2=5.707 4，P

2.3　胃黏膜病變組織中PTEN蛋白的表達　SIM組織中PTEN蛋白的陽性表達率為86.9%（20/23），AIM組織中的陽性表達率為75.8%（25/33），胃癌組織中的陽性表達率為47.7%（21/44）。PTEN蛋白在SIM組織中的表達顯著高于胃癌組織（χ2=9.788 5，P0.05），AIM組織與胃癌組織的表達差異亦無統(tǒng)計學意義（χ2=2.701 0，P>0.05）。

3　討論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤前列。早診斷、早治療是目前提高胃癌患者生存率的唯一有效措施。臨床胃鏡活組織檢查的廣泛應用使早期胃癌的診斷成為可能。但臨床實踐發(fā)現(xiàn)，胃鏡活組織檢查技術對早期胃癌的檢出率并無很大提高，大部分胃癌患者確診時已屬于晚期胃癌，其主要原因可能與對胃癌前期變化認識不夠充分、不明確胃黏膜腸化的類型和胃癌的關系、不能為臨床提供可靠的胃黏膜癌前病變隨訪資料有關。

胃黏膜腸化是指正常胃黏膜上皮細胞在一定條件下（如炎癥等）轉(zhuǎn)化為腸型上皮細胞，是胃黏膜的常見病變，部分腸化病變與胃癌的發(fā)生發(fā)展關系密切，形成正常胃黏膜淺表性胃炎萎縮性胃炎腸化異型性增生胃癌（腸型）的多步驟發(fā)展過程。臨床胃鏡活組織檢查中發(fā)現(xiàn)在胃黏膜良、惡性病變中有大量的腸上皮化生，幾乎所有萎縮性胃炎均有腸化病變。但事實上并不是所有類型的腸化均有轉(zhuǎn)化成胃癌的風險，這為臨床醫(yī)師對隨訪患者行早期胃癌監(jiān)測帶來了困難。目前腸化按化生上皮的形態(tài)及黏液成分主要分為3型：完全腸化型（Ⅰ型）、不完全小腸型（Ⅱ型）和不完全結(jié)腸型（Ⅲ型）。但由于黏液成分復雜，且腸化病變常常以多種黏液分泌為主，難以通過黏液染色分類?，F(xiàn)代分子生物學證實在腸化病變中均有大腸及小腸分化，病灶之間大腸或小腸分化并無顯著差異。

本研究對胃黏膜腸化的病理切片進行觀察分析，根據(jù)組織形態(tài)學把胃黏膜腸化分為SIM和AIM兩種類型，結(jié)果顯示AIM與胃癌關系密切，屬胃黏膜癌前病變范疇。

CDX2基因?qū)偻春谢蚣易宓囊活?，其編碼的CDX2蛋白包含311個單氨基酸，通過螺旋－環(huán)－螺旋的方式結(jié)合于DNA的相應區(qū)域，以轉(zhuǎn)錄因子的形式調(diào)節(jié)DNA的表達。成年人CDX2蛋白主要表達于小腸和結(jié)腸， 對腸上皮細胞的分化、增殖、凋亡和腸道特定基因的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用，而正常胃黏膜組織中無表達。目前研究認為CDX2蛋白具有誘導胃黏膜細胞向腸上皮分化的作用，啟動了胃黏膜腸化［5］。

本研究結(jié)果顯示CDX2蛋白在SIM、AIM和胃癌組織中的表達逐漸下降，CDX2蛋白陽性表達見于82.6%的SIM、51.5%的AIM及46.2%的腸型胃癌組織中，提示CDX2蛋白在胃黏膜腸化到癌變的過程中起重要作用，其表達水平隨著惡性程度的增加而下降。但CDX2蛋白在AIM與胃癌組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示AIM與胃癌的關系密切，這與組織形態(tài)觀察結(jié)果一致。因而推測SIM多為炎癥等因素造成胃黏膜上皮損傷后增生修復的適應性改變；AIM為上皮適應性改變的同時伴有基因改變?nèi)缒承┗虮磉_異常等，在此基礎上進一步發(fā)生癌變。

本研究還發(fā)現(xiàn)有少數(shù)病例CDX2蛋白表達部位不在細胞核，而在核周細胞質(zhì)中，且呈塊狀分布而非彌漫分布，推測為某一細胞器內(nèi)的CDX2蛋白，與劉貴生等［6］發(fā)現(xiàn)類似，其發(fā)生機制需要進一步研究。也有學者認為CDX2在細胞質(zhì)的表達與幽門螺桿菌引起的炎癥有關［7］。

Bai等［8］發(fā)現(xiàn)CDX2蛋白的表達與胃癌組織類型相關， 腸型胃癌高于彌漫型。但也有學者認為CDX2蛋白在兩種類型胃癌中表達并無差異［9］。本研究發(fā)現(xiàn)， CDX2蛋白表達于36.4%（16/44）的胃癌組織中， 其中46.2%（12/26）的腸型胃癌病例CDX2蛋白表達陽性，而彌漫型胃癌中CDX2蛋白表達陽性的病例僅占22.2%（4/18），與Bai等［8］的結(jié)果類似。分析原因可能與胃癌細胞來源不同有關，腸型胃癌起源于胃黏膜腸化生灶，而彌漫型胃癌則可能來源于非腸化生細胞。因此CDX2蛋白在腸型胃癌組織中較彌漫型胃癌組織表達增加［6］。

PTEN基因為具有磷酸酶活性抑癌基因， 編碼酪氨酸磷酸酶，抑制酪氨酸磷酸化，對細胞增殖和細胞周期起調(diào)控作用。有研究認為啟動子異常甲基化是PTEN基因失活的主要機制［10］，從而導致其磷酸酶活性明顯下降，細胞惡性增殖能力增強，細胞游走性增加并抑制細胞凋亡，促進腫瘤進行性生長和腫瘤細胞增殖活性增加。Sunghoon等［11］發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細胞系中抑癌基因PTEN可以通過刺激CDX2啟動子轉(zhuǎn)錄活性來增強CDX2的表達，提示在腸化中PTEN對CDX2的表達可能起到一定的調(diào)節(jié)作用。與CDX2相似，PTEN編碼產(chǎn)物在SIM、AIM和胃癌組織中表達逐漸下降。但與CDX2不同的是PTEN在SIM與AIM的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示CDX2的表達存在著復雜的調(diào)節(jié)機制，PTEN只是影響因素之一。

在胃黏膜腸化及癌變的過程中，CDX2蛋白的異常表達是重要因素之一。AIM與胃癌的關系密切，其具體的癌變機制有待于進一步研究。目前共聚焦激光顯微內(nèi)鏡已能較準確的診斷胃癌，其敏感性為84％，特異性為95％，準確性為80％，可以對胃癌做出在體的診斷［12］。如果將腸化分類方法與共聚焦顯微內(nèi)鏡技術相結(jié)合，應用于AIM患者的初步篩選，有望提高早期胃癌的檢出率。

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篇7

【摘要】 【目的】探討乳腺癌患者的乳腺癌耐藥蛋白(bcrp)基因表達及其與化療療效的關系?！痉椒ā坎捎冒攵磕孓D(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(rtpcr)的方法檢測60例行新輔助化療cef方案的女性乳腺癌患者乳腺癌組織的bcrp基因，根據(jù)化療前bcrp基因表達情況，將60例患者分為陽性組及陰性組，比較2組間的療效，觀察bcrp基因表達與化療療效的關系?！窘Y(jié)果】60例乳腺癌患者中bcrp基因陽性表達17例，陽性表達率為283%(17/60)。bcrp基因陽性組患者總緩解11例，緩解率(647%)明顯低于陰性組(930%),兩組比較差異有顯著性意義(p<005)?！窘Y(jié)論】bcrp 基因高表達患者采用cef方案化療效果較差，bcrp基因的表達水平可以作為預測化療效果的一個重要參考指標。

【關鍵詞】 乳腺腫瘤/藥物療法;乳腺癌耐藥蛋白基因;半定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應

多藥耐藥是影響乳腺癌化療效果的重要因素之一，乳腺癌耐藥蛋白(bcrp)是1998年被發(fā)現(xiàn)的又一與耐藥有關的糖蛋白，其在腫瘤耐藥中的作用日益受到關注。133229.coM本研究應用半定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(rtpcr)的方法檢測60例行新輔助化療患者乳腺癌組織的bcrp基因表達，并觀察其與化療療效的關系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1材料與方法

11病例選擇60例均為我院乳腺科2005~2008年住院行新輔助化療的女性乳腺癌患者,年齡30～65歲,中位年齡45歲。所有病例均經(jīng)巴德槍粗針穿刺病理確診，均未接受過手術、放療、化療、內(nèi)分泌治療等抗癌治療的原發(fā)乳腺癌患者，并排除其他腫瘤。按照國際抗癌聯(lián)盟(uicc)2002年tnm分期標準:ⅱ期27例，ⅲ期29例，ⅳ期4例。其中ⅳ期患者中1例胸椎轉(zhuǎn)移，1例胸骨轉(zhuǎn)移，1例肺轉(zhuǎn)移，1例肝轉(zhuǎn)移(以臨床ct/mr診斷為標準)。按照世界衛(wèi)生組織(who)乳腺腫瘤組織學類型分類標準:浸潤性導管癌53例，浸潤性小葉癌3例，黏液腺癌3例，髓樣癌1例。

12試劑trizol試劑(invitrogen公司)，takars rna pcr kit(amv)ver30試劑盒(大連寶生物有限公司)，depc(大連寶生物有限公司)。引物光探針合成(上海生工公司)：bcrp上游引物序列為5ttaggattgaagccaaagg3’,下游引物序列為5taggcaattgtgaggaaaata3’;βactin上游引物序列為5ctcgcgc tactctctctttc3’，下游引物序列為5catgtctcgatcccacttaac3’。

13藥物療效判斷標準根據(jù)化療前bcrp基因表達情況，將60例患者分為陽性組及陰性組，并采用cef方案[環(huán)磷酰胺05 g/m2 ,第1天(d1)+法瑪新80 mg/m2 ,d1+5氟脲嘧啶05 g/m2 ,d1]。21d為1個療程，3個療程后，按who實體瘤的近期療效標準評定療效，分為完全緩解(cr)、部分緩解(pr)、疾病穩(wěn)定(sd)、進展(pd)。

14乳腺癌耐藥基因的檢測采用半定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(rtpcr)的方法。

141rna提取腫瘤組織總rna提取采用異硫氰酸胍、酚、氯仿抽提“一步法”[1]。紫外光分光光度計準確定量，沉淀于無rnaase水中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

142cdna合成按one step rtpcr 試劑盒(日本takara 公司) 說明書配制rtpcr 反應體系10μl, 含總rna 1μg、mgcl2 2μl、10倍rt buffer 1μl、dntp液體 1μl、rnase抑制酶 025μl、oligodt 05μl、amv酶 05μl、加入depc處理水至10μl，30℃、10min，42℃、30min，99℃、5min，5℃、5min。

143pcr反應rt產(chǎn)物10μl，5倍pcr buffer 10μl，ex taq酶 025μl，bcrp上、下游引物1μl(125pmol)，βactin上、下游引物1μl(125pmol)，滅菌蒸餾水2775μl置于pcr擴增儀上，反應條件為94℃、2min 預變性，然后按94℃、40s，55℃、60s，72℃、60s，共35個循環(huán);72℃延伸10min。

144電泳取10μl pcr產(chǎn)物進行電泳，用20g/l瓊脂糖凝膠電泳，eb染色，以5v/cm電泳60min，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析掃描定量并照相，以bcrp/β2mg的比值作為bcrp基因的相對表達水平。bcrp基因電泳結(jié)果有2個條帶，即bcrp 446bp及βactin 330bp，以bcrp/βactin的比值<05為bcrp表達陰性，以bcrp/βactin的比值≥05為bcrp表達陽性[1]。

15統(tǒng)計學方法將實驗數(shù)據(jù)輸入spss 100統(tǒng)計軟件包，采用χ2檢驗分析陽性表達率，p<005為具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

21乳腺組織中bcrp mrna表達乳腺組織中bcrp mrna表達的pcr產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖1。60例原發(fā)乳腺癌中bcrp基因陽性表達17例，陽性表達率為283%(17/60)。

① 為marker dl2000(dna分子量標準);②為bcrp mrna表達陰性;③為bcrp mrna表達陽性

22bcrp基因表達與化療療效的關系表1結(jié)果顯示，60例原發(fā)乳腺癌患者中，bcrp基因陽性組患者總緩解11例，緩解率(647%)明顯低于陰性組(930%)，兩組比較差異有顯著性意義(p<005)。表12組療效比較

3討論

bcrp是與多藥耐藥相關的膜轉(zhuǎn)運蛋白，主要參與膜內(nèi)、外藥物轉(zhuǎn)運而改變藥物在胞內(nèi)的分布，在轉(zhuǎn)運細胞毒化療藥物中以“半—轉(zhuǎn)運”方式排出藥物，屬于atp轉(zhuǎn)運蛋白的超家族成員。bcrp基因在乳腺癌中的表達情況報道結(jié)果尚不一致。本研究結(jié)果顯示，60例乳腺癌中bcrp基因陽性表達17例，陽性表達率為283%。與kanzaki等[2]采用ptpcr方法檢測43例初治乳腺癌患者手術切除腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)9例標本有較高水平的bcrp基因表達基本相近。

腫瘤耐藥是多基因參與的結(jié)果，了解耐藥基因的表達，對于選擇合適的治療方案和實施有效的逆轉(zhuǎn)措施具有重要的指導意義。bcrp是abc轉(zhuǎn)運子編碼基因家族的成員之一，該基因產(chǎn)物的過表達常伴有乳腺癌化療耐藥，并呈現(xiàn)出多藥耐藥性。耐藥蛋白bcrp的底物廣泛，bcrp表現(xiàn)型的耐藥細胞對包括蒽環(huán)類藥物、拓撲替肯(tpt)、氨甲蝶呤(mtx)、vp16等許多抗腫瘤藥物耐藥[3]。本研究結(jié)果表明，bcrp mrna高表達者對cef方案化療效果較差，bcrp mrna的表達水平可以作為預測化療效果的一個重要參考指標。因此，本項目研究的完成對臨床合理地制定化療方案、選擇化療藥物的種類、避免不必要的化療藥物副作用，具有一定的指導意義。

【參考文獻】

[1] 管俊，盛瑞蘭，顧健急性非淋巴細胞性白血病患者乳腺癌耐藥蛋白基因表達及其臨床意義[j].白血病·淋巴瘤，2002，11(3)：139

篇8

【關鍵詞】 高敏C反應蛋白 動脈粥樣硬化 氣虛血淤

Abstract：AS is an inflammatory disease which exists in "healthy" people as a dormant syndrome. Qideficiency and Blood-stagnation is the main pathogenesis of AS. Creactive protein (CRP) participates in the occurrence and progress of AS. It is the independent risk factor and prognostic index of AS. We propose that high sensitivity CRP (hsCRP) should be the screen marker of pathogenesis of Qideficiency and Bloodstagnation. If the high hsCRP case have abnormality in routine examination of AS， We suggest that use the treatment based on syndrome differentiation based on replenishing Qi and activating blood circulation which combined with the pathogenesis and the physic of the patient. This work would help to prevent and therapy AS with TCM and deepen the principle of "preventive treatment before the occurrence of diseases".

Key words：hsCRP; Atherosclerosis; Qideficiency and Bloodstagnation

辨證施治是根據(jù)傳統(tǒng)的陰陽五行等中醫(yī)基本理論來認識疾病，并指導診斷、立法、處方、用藥的法則，是中醫(yī)防治疾病的核心和準則。它主要運用司外揣內(nèi)的方法，將內(nèi)在機能系統(tǒng)失調(diào)的機制整合為外觀的相關生命現(xiàn)象的改變，以此作為論治的基礎。然而，疾病初期常常會無證可辨，如動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS），在出現(xiàn)嚴重的心腦血管事件之前，會長期存在一種“病已形成于內(nèi)、證尚未見于外”的狀態(tài)，面對這種“已病未證”的情況，如何進行中醫(yī)藥的防治呢？

1 AS炎癥是一種潛證

1.1 AS是一種炎癥1999年，Ross提出AS是一種炎性疾病［1］。炎癥在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展和演變過程中起著重要作用，貫穿于AS從起始發(fā)病到出現(xiàn)臨件的整個過程：炎癥是動脈粥樣硬化的始動因子，炎癥導致血管局部中性粒細胞和單核細胞浸潤，促進脂質(zhì)沉積，導致動脈粥樣硬化脂紋等早期病變的發(fā)生。從內(nèi)皮功能障礙到脂質(zhì)條紋形成，從纖維斑塊和粥樣斑塊到不穩(wěn)定斑塊的生成、破裂和血栓形成，動脈粥樣硬化易損斑塊最顯著特征之一是為炎癥反應。這種炎癥反應中，有單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞參與，并產(chǎn)生許多細胞因子、黏附分子和炎癥介質(zhì)等。AS斑塊的破裂或脫落最終引起心肌梗塞、一過性腦缺血發(fā)作、中風等嚴重疾病。因此，AS是一種慢性炎癥。

1.2 AS炎癥是潛證AS炎癥始于胎兒期，孩童和青少年時期緩慢發(fā)展。尸檢研究證實，在年輕和“健康”的個體上存在嚴重和阻塞性損害；冠狀動脈內(nèi)超聲顯示，20～29歲的健康心臟志愿者中AS的罹患率為37%，30～39歲的罹患率為60%，而超過50歲人群的罹患率為85%［2］。從AS的自然發(fā)展過程來看，當致病因子剛作用于機體尚未引起嚴重的臨件之前，AS處于病理生理變化緩慢積累的量變過程，其本質(zhì)特性尚未顯露，外在表現(xiàn)是健康狀態(tài)，此時，AS處于“有諸內(nèi)”尚未“形諸外”的“潛證”階段。

2 氣虛血淤是AS潛證的病機辨證特征

氣虛血淤傾向是現(xiàn)代人群一個突出的體質(zhì)病理學特征［3］，是人體衰老的主要機制［4］，同時現(xiàn)代人罹患AS的幾率非常高，冠心病的病機關鍵是氣虛血淤［5］，而冠心病的發(fā)病基礎是AS；氣虛血淤證的病理生理基礎主要表現(xiàn)在內(nèi)皮功能障礙［6］，這同時也是AS的啟動步驟［2］，我們因此推斷，氣虛血淤是AS潛證的病機關鍵。

氣虛血瘀的“氣虛”之氣主要是指宗氣［7］，《靈樞·邪客》指出：“宗氣積于胸中，出于喉嚨，以貫心脈”，宗氣“不但為全身諸氣之綱領，并可為全身血脈之綱領（張錫純）”，在AS發(fā)生過程中，宗氣維系脈管的正常功能，具體就是維持內(nèi)皮功能，抑制或延緩AS的發(fā)生發(fā)展?！鹅`樞·刺節(jié)真邪篇》曰“宗氣不下，脈中之血凝而留止”，《諸病源候論》說“血之在身，隨氣而行，常無停積，若因墮落損傷，血行失度……皆成淤血”，說明了氣是血液運行的動力，氣的推動作用對維持血液正常運行的重要性；宗氣虛弱不足，氣的推動作用減弱，運血無力，可致血液流行緩慢，單核細胞黏附于內(nèi)皮，釋放致炎因子，導致了炎癥的發(fā)生，是淤血形成的前提。

一旦內(nèi)皮功能障礙，出現(xiàn)氣虛血淤的病機變化，可表現(xiàn)為內(nèi)皮表達和分泌血管活性物質(zhì)異常，如凝血、抗凝、纖溶等功能異常：一氧化氮、組織因子途徑抑制物、組織型纖溶酶原激活物等抑炎物分泌減少；內(nèi)皮素、組織因子、纖溶酶原激活物抑制因子等致炎因子分泌增高［6］，單核細胞浸潤，炎癥細胞募集，表明氣虛血淤的本質(zhì)是一種基于血管內(nèi)皮和炎癥細胞的低度、慢性炎癥。氣的防御作用減弱，是發(fā)生低度炎癥的重要條件；淤血是低度炎癥的主要病理產(chǎn)物。因此，AS炎癥的病機辨證當屬氣虛血淤。

3 CRP是AS氣虛血淤病機的辨證標記

3.1 CRP是AS炎癥的參與者C反應蛋白（Creactive protein， CRP）參與了AS發(fā)生、穩(wěn)定斑塊向不穩(wěn)定斑塊的轉(zhuǎn)化乃至斑塊破裂的全過程：①CRP調(diào)節(jié)巨噬細胞攝入低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol， LDL-C）有助于泡沫細胞的形成；②誘導黏附分子如血管細胞黏附因子1、細胞間黏附因子-1、E選擇素和單核趨化蛋白-1的表達；③抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性，降低血管反應性；④激活粥樣斑塊內(nèi)的補體系統(tǒng)、致敏內(nèi)皮細胞，產(chǎn)生CD4+ T細胞介導的細胞毒作用造成損壞，促進AS的進展［8］。

3.2 hs-CRP是AS的標記物CRP是炎癥的非特異標志物，但與其它炎癥標記物不同，CRP水平長期穩(wěn)定性高，晝夜差異小，且檢測費用低廉，因此是檢測AS炎癥病機變化的重要標志。許多前瞻性的流行病學研究結(jié)果均證實，在穩(wěn)定的個體中采用高敏方法測定的高敏CRP（high sensitivity CRP， hsCRP），不管LDLC水平如何，F(xiàn)ramingham危險性評分怎樣，代謝綜合征嚴重程度處于何種水平，hsCRP都是一個預測未來心血管事件發(fā)生危險性的有效指標［9］。RidkerPM等［10］研究結(jié)果表明，hsCRP和LDLC各自基線水平與心血管事件發(fā)生高度線性相關，hsCRP有獨立預示作用，是一個比LDLC更好的心血管事件預示指標。hsCRP值甚至在血樣檢測的20年后仍有預測價值，是一個很好的危險性預測標志物。2003年，AHA/CDC專家組在Circulation上撰文提出要把hsCRP應用于臨床及公共衛(wèi)生實踐。

3.3 hsCRP作為AS氣虛血淤潛證的標記物hsCRP與腹部肥胖，高甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇水平降低、高血壓及空腹高血糖有關，而且與胰島素敏感性，內(nèi)皮細胞功能減退及纖維蛋白溶解降低等因素相關，上述代謝綜合征的因素越多，hs-CRP水平越高，AS發(fā)生的幾率越大，AS的嚴重程度越高。

以hsCRP作為AS潛證病機辨證標記的邏輯是，AS是一種潛證，其主要病機是氣虛血淤；CRP是AS炎癥的參與者，并且hsCRP是AS相關心血管事件的標記物；因此，hsCRP可以作為AS氣虛血淤病機的標記物。

用hsCRP作為氣虛血淤病機的標記盡管具有較大的可行性，但事實上，沒有一個指標能說明所有問題，特別是AS這樣一個復雜的疾病潛證。因此，在臨床中要既要考慮Framingham 危險性評分，LCLC水平等現(xiàn)代水平檢測，又要注意體重、肥胖、運動、糖尿病等傳統(tǒng)因素。應用早期、靈敏的標志物來監(jiān)測AS將有助于指導傳統(tǒng)中醫(yī)理論從疾病早期防治AS；中醫(yī)幾千年積累的經(jīng)驗也將有助于在AS的潛證階段進行防治。

最有可能從hsCRP評價中受益的人群是低或正常LDLC的人群。從高脂蛋白血癥的分類來看，高LDLC屬于II型高脂蛋白血癥，與AS發(fā)生關系密切，應進行調(diào)脂治療。大規(guī)模的臨床試驗證實，大部分病人會從他汀類藥物干預中受益。而對于“低LDLC、高hsCRP”的“健康個體”來說，雖然其未來發(fā)生血管事件的危險性明顯高于“高LDLC、低hsCRP”個體［10］，但目前尚無公認的干預方案。這些病人不能被診斷為高脂蛋白血癥，因此不需要進行調(diào)脂治療；由于LDLC水平低于130 mg/dl的一級預防標準，病人很少會冒險采用他汀類藥物治療，因為他汀類藥物能引起明顯的肝功下降、肌肉疼痛，并曾在歐美國家導致30多人死亡（國家藥品監(jiān)督管理局為此停用西立伐他汀鈉）。因此，針對hsCRP的氣虛血淤病機辨證，給予益氣活血的中醫(yī)藥調(diào)治可能是填補這個“空白”的方案之一，中醫(yī)幾千年積累的經(jīng)驗也將有助于在AS的潛證階段進行防治。

用于AS病機篩查目的的CRP檢測，必須使用高敏法，免疫濁度法較為合適。一些方法如ELISA、免疫發(fā)光法和化學發(fā)光法雖然靈敏度和精確度都較高，但其成本也較高，故不是進行篩查的首選方法。近年來，膠乳增強免疫透射比濁法已被證實可作為測定CRP的常規(guī)高敏方法。

在健康人群，建立hsCRP水平與AS氣虛血淤病機之間的聯(lián)系，結(jié)合LDLC水平、內(nèi)皮功能障礙水平、超聲多普勒檢查的斑塊形成情況，使AS氣虛血淤的hsCRP篩查包含更豐富的內(nèi)涵，以此為基礎，建立以益氣活血為主的干預方案，可能會有效地預防AS。

4 結(jié)語

隨著社會的發(fā)展，醫(yī)學目的已經(jīng)調(diào)整為以預防為主，依靠科技進步，動員全社會參與，中西醫(yī)并重，為人民健康服務的方針?！端貑枴に臍庹{(diào)神大論》明確提出：“是故圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂，此之謂也。夫病已成而后藥之，亂已成而后治之，譬猶渴而穿井，斗而鑄錐，不亦晚乎”?因此，運用疾病早期標志物診查疾病潛證階段的病機變化，并以此作為病機辨證的參考和療效判斷的標準，則將有助于“消未起之患，治未病之疾，醫(yī)之于無事之前”。

中醫(yī)具有良好的群眾基礎，國人在出現(xiàn)明顯的疾病之前多不愿服用西藥，因此，利用國人喜用中藥調(diào)理的特點，充分發(fā)揮中醫(yī)的治未病優(yōu)勢預防AS，具有極大的理論價值和社會效益。

【參考文獻】

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篇9

[關鍵詞] 新生兒；動脈導管未閉；肌鈣蛋白；心肌酶譜

[中圖分類號] R722.19 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）09（b）-084-04

[Abstract] Objective To measure the different levels of cardiac troponin I （cTnI） and creatine kinase （CK）， creatine kinase MB （CK-MB） in the patent ductus arteriosus （PDA） infants. Methods Thirty-seven neonates who were admitted to Department of neonatology， Shanghai Children's medical Center， School of Medicine， Shanghai Jiao Tong University from January 2014 to January 2016 were recruited. Neonates with PDA were assigned to observation group. The observation group was further divided into different subgroups （NRDS group and non-NRDS group， mechanical ventilation group and non-mechanical ventilation group， use Dopamine group and not use Dopamine group） according to whether combination with NRDS， whether the use of mechanical ventilation and Dopamine. Thirty-seven neonates had the same gestational age and the same gender with the observation group and no severe congenital heart disease and asphyxia admitted at the same period were selected as the control group. Levels of cTnI， CK and CK-MB of patients in 3-7 days after birth were tested and compared. Results The cTnI level of observation group was significantly higher than those of the control group （P < 0.05）. There was no significant difference in CK and CK-MB level between the observation group and the control group. The cTnI level of the use Dopamine group was significantly higher than that of the not use Dopamine group （P < 0.05）. There was no significant difference in cTnI， CK and CK-MB level between NRDS group and non-NRDS group， mechanical ventilation group and non-mechanical ventilation group in the observation group. Conclusion It is needed to be pay close attention to whether there is open PDA for 3-7 days newborn with high level of serum cTnI. cTnI is more sensitive than CK and CK-MB in the myocardial damage of neonates with PDA. Higher cTnI level of neonates with PDA is more likely to occur the circulatory problems of Dopamine medicinal indication.

[Key words] Neonate； Patent ducts arteriosus； Cardiac Troponin； Serum myocardial enzyme

新生兒動脈導管未閉（Patent ductus arteriosus，PDA）是指主動脈與肺動脈之間的通道在新生兒出生后未能及時關閉。在足月活產(chǎn)新生兒中PDA的發(fā)生率為57/10萬[1]，而體重位于501～1500 g的早產(chǎn)兒中，有1/3患有持續(xù)性PDA[2]。PDA是造成新生兒心力衰竭的主要原因之一，重者出現(xiàn)支氣管肺發(fā)育不良、壞死性小腸結(jié)腸炎等嚴重并發(fā)癥[3-5]。血清肌鈣蛋白I（cTnI）與磷酸肌酸激酶（CK）、磷酸肌酸激酶雜化型（CK-MB）均是心肌損傷的標志物。PDA時心肌細胞受到損傷，cTnI與CK、CK-MB水平上升。觀察患兒cTnI與CK、CK-MB水平有助于早期判斷PDA患兒是否存在早期心肌損傷。本文回顧性分析了74例新生兒的臨床資料，旨在比較PDA新生兒cTnI與CK、CK-MB的表達水平，為進一步幫助臨床早期干預PDA提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月～2016年1月在上海兒童醫(yī)學中心新生兒科住院患兒74例。其中心臟超聲診斷為PDA，并排除合并其他先天性心臟病及重度窒息的新生兒37例為觀察組。根據(jù)是否合并新生兒呼吸窘迫綜合征（Neonatal respiratory distress syndrome，NRDS）將觀察組分為合并NRDS組（8例）和無NRDS組（29例）。NRDS診斷標準：①早產(chǎn)兒生后出現(xiàn)進行性呼吸困難；②胸部X線特征性改變：兩肺透亮度降低、支氣管充氣征、白肺。根據(jù)是否使用過呼吸機分為使用呼吸機組（16例）和未使用呼吸機組（21例）；根據(jù)有無使用多巴胺分為使用多巴胺組（8例）和未使用多巴胺組（29例）。將其中具有同樣性別分布、胎齡的新生兒37例作為對照組，排除合并先天性心臟病及重度窒息者，其中早產(chǎn)兒23例，新生兒高膽紅素血癥6例，肺炎8例。

1.2 觀察指標

1.2.1 資料收集 建立病例資料表，記錄患兒性別、分娩方式、胎齡、出生體重；記錄NRDS、機械通氣及多巴胺使用情況；記錄患兒PDA的轉(zhuǎn)歸。

1.2.2 床旁超聲心動圖檢查 使用飛利浦SONOS 5500超聲儀器，超聲探頭8 MHz。在生后7 d內(nèi)對有心臟雜音或者皮膚青紫的新生兒進行床旁超聲心動圖檢查。記錄PDA內(nèi)徑大小、分流方向。

1.2.3 cTnI與CK、CK-MB 所有研究對象均于生后3～7 d抽取靜脈血3 mL檢測cTnI與CK、CK-MB。cTnI采用化學發(fā)光法，正常參考值：

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，對各項指標進行正態(tài)性檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料改用中位數(shù)M，四分位數(shù)間距Q（P25，P75），兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 總體資料及分組情況

觀察組與對照組胎齡、出生體重比較差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。兩組出生方式、合并NRDS、使用機械通氣、使用多巴胺者所占比較比較差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。觀察組中PDA自愈10例；使用布洛芬關閉成功2例、失敗1例；未處理24例。

2.2 觀察組與對照組cTnI、CK、CK-MB的比較

觀察組和對照組cTnI的比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；觀察組和對照組CK、CK-MB的比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

2.3 觀察組亞組的cTnI、CK、CK-MB的比較：

觀察組中使用多巴胺組與未使用多巴胺組cTnI比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；CK、CK-MB比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），見表3。觀察組中合并NRDS組與未合并NRDS組cTnI、CK、CK-MB比較差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），見表4。觀察組中使用機械通氣組與未使用機械通氣組cTnI、CK、CK-MB比較差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

3 討論

PDA是新生兒較為常見的疾病之一，近年來新生兒PDA可通過手術結(jié)扎、導管介入、口服布洛芬、輸富含血小板的血漿等多種手段得到治療[6-8]。但多項研究指出，新生兒PDA存在很高的自愈率，故新生兒PDA是否需要干預以及何時需要干預都存在較大分歧[9-10]。有意見指出血流動力學顯著改變PDA（hsPDA）需要進行臨床干預，而診斷hsPDA需要較為復雜的臨床及心臟超聲標準[11]。肌鈣蛋白及CK、CK-MB是心肌損害的很好的標志物，這些標志物與hsPDA之間存在顯著相關性[12]。

血清生物標志物如肌鈣蛋白、CK、CK-MB最早應用于成人心肌梗死的診斷[13]。肌鈣蛋白是肌鈣蛋白T、I、C組成的復合物。其中cTnI具有較高的特異性和靈敏度。Trevisanuto等[14]研究顯示在新生兒臍血中可檢測到cTnT，但檢測不到cTnI，說明新生兒體內(nèi)的cTnI均來自于自身，不受孕母的干擾。McNamara等[15]提出由于PDA時降主動脈內(nèi)血流竊向肺動脈，引起降主動脈內(nèi)血流減少，全身動脈包括冠狀動脈灌注不足，造成心肌缺血和cTnT水平上升。本研究中觀察組與對照組在cTnI上的差異有統(tǒng)計學意義，觀察組cTnI水平明顯高于對照組，說明PDA會導致心肌損傷，造成cTnI水平明顯升高。臨床上，若新生兒生后3～7 d內(nèi)cTnI水平升高，則需密切關注患兒是否存在PDA開放。

目前已有許多研究提示肌鈣蛋白診斷心肌損傷的特異性和敏感性均高于CK、CK-MB[16]。推測原因是其不僅存在于心肌中，也存在于骨骼肌、腦組織和胃腸道平滑肌等處，其受到多種因素干擾。而cTnI是心肌唯一特異的心肌蛋白。故在心肌損傷時cTnI較CK、CK-MB更為敏感。本研究顯示在觀察組cTnI水平明顯高于對照組的同時，兩組之間CK、CK-MB水平無顯著差異，也說明了這一點。

多巴胺可提高新生兒肺血管阻力和肺動脈壓力，從而減少主動脈內(nèi)血流竊向肺動脈，提高主動脈血壓[17]。新生兒PDA由于左向右分流，使得全身動脈血流減少，可導致患兒動脈收縮壓、舒張壓下降，臨床上使用多巴胺的概率增大[18-19]。本研究顯示在觀察組中，多巴胺組與未使用多巴胺組在cTnI水平上差異具有統(tǒng)計學意義。推測由于臨床上PDA患兒應用多巴胺的原因大多是由于患兒動脈血壓降低難以維持循環(huán)，而動脈血壓下降則可導致冠狀動脈內(nèi)血流減少，進而造成心肌損害引起cTnI水平上升。多巴胺組肌鈣蛋白水平更高，說明肌鈣蛋白與心肌損害明顯相關，更易出現(xiàn)多巴胺用藥指征下的循環(huán)問題。

觀察組中合并NRDS組與未合并NRDS組、使用機械通氣組和未使用機械通氣組的cTnI、CK、CK-MB水平差異均無統(tǒng)計學意義。NRDS導致低氧血癥，而使用機械通氣的新生兒往往也是臨床上出現(xiàn)低氧血癥的患兒。低氧血癥可直接損害心肌細胞。Trevisanuto等[20]的研究發(fā)現(xiàn)NRDS早產(chǎn)兒的cTnT水平明顯增高。Distefano等[21]的研究也有同樣的結(jié)論。推測本研究由于病例數(shù)目較少未能得出陽性統(tǒng)計學結(jié)論。

綜上所述，PDA可造成新生兒心肌細胞損傷，導致血清中cTnI及CK、CK-MB水平上升，而cTnI較CK、CK-MB更為敏感，更能反映新生兒PDA患兒的心肌損害情況。新生兒早期cTnI水平高的PDA患兒更易出現(xiàn)多巴胺用藥指征下的循環(huán)問題。

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篇10

【關鍵詞】 逐淤化痰湯 腦出血 細胞凋亡 Bcl-2蛋白 Bax蛋白

Abstract: Objective To probe into the effect of edaravone on the cell apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax protein following intracerebral hemorrhage(ICH) in rats， and explore the protective effect of edaravone on the cerebral injury induced by hemorrhage. Methods Ninety SD rats were randomly pided into 3 groups: Zhuyuhuatan oral liquid group， ICH group and sham group(n=30).The rat model of ICH was established by injection of autologous blood into the caudate nucleus. At different time separately neuronal apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax protein were monitored by Hoechst and immunohistochemistry，respectively. Results Apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax protein were significantly increased in the ICH group as compared with the sham group(P＜0.01). Treatment of Zhuyuhuatan oral liquid markedly reduced apoptosis ahd the expression of Bax protein in comparison to the ICH group(P＜0.05 or ＜0.01)，while the expression of Bcl-2 was obviously higher in the Zhuyuhuatan oral liquid group than that in the ICH group(P＜0.05 or P＜0.01). Conclusions Zhuyuhuatan oral liquid inhibits the neuronal apoptosis following intracerebral hemorrhage which might be relative to the alleviated oxidative stress， up regulated Bcl-2 protein and down regulated expression of Bax protein.

Key words:Zhuyuhuatan oral liquid; cerebral hemorrhage; apoptosis; Bcl-2 protein; Bax protein

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是神經(jīng)系統(tǒng)常見病和多發(fā)病。研究表明，細胞凋亡機制參與了腦出血繼發(fā)性神經(jīng)細胞損傷［1，2］?，F(xiàn)階段中藥方劑在腦出血的治療中仍然發(fā)揮著重要作用，但傳統(tǒng)觀念認為有引起出血加重危險，故多應用于腦出血恢復期。最新研究表明，腦出血急性期應用逐淤化痰藥物療效更好［3］。逐淤化痰湯（Zhuyuhuatan oral liquid）治療腦出血療效確切，一般用于腦出血恢復期。本實驗觀察大鼠腦出血急性期應用逐淤化痰湯后血腫周圍腦組織內(nèi)細胞凋亡及Bcl-2（B細胞淋巴瘤/白血病-2）、Bax蛋白的表達情況，為逐淤化痰湯治療急性期腦出血提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠共90只，體重200～300 g，3～4月齡，（由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供）。

1.1.2 藥品和試劑

逐淤化痰湯（鉤藤、生大黃各15 g，水蛭、三七、郁金各10 g，紅參12 g，丹參20 g）由錦州醫(yī)藥公司購進，取液250 mL按1∶1濃度水煎，于遼寧醫(yī)學院中藥制劑室制成含生藥1 g/mL，冰箱冷藏備用。Bcl-2，Bax測定試劑盒（購自武漢博士德公司），細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒（購自碧云天生物技術研究所）

1.1.3 主要實驗儀器

立體定位儀：（美國STOELTING公司），微量進樣器（上海安亨微量進樣器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥

隨機分為假手術組、腦出血模型（ICH）組及逐淤化痰湯治療組，每組30只。每組又分為術后1、2、3、5、7d，5個時間點，每個時間點各6只。逐淤化痰湯治療組于造模后6 h開始灌喂給藥，用量為每次1 g/kg，2次/日（用量相當于70 kg人相同體表面積用量的3 倍）。腦出血組：造模后1 d開始灌喂等量生理鹽水，2次/日。假手術組：除不注入自體血外，其余條件同ICH組。

1.2.2 腦出血模型的制備

參照Xue［4］和Yang［5］方法將大鼠稱重后給予10%水合氯醛（3.3 mL/kg）腹腔注射麻醉，大鼠俯臥位，頭部固定在腦立體定位儀上。腦立體定位儀定位大鼠右側(cè)尾狀核（前囟后0.2 mm，矢狀縫向右旁開3.0 mm，深度6.0 mm）［6］；切開頂部中線皮膚，以前囟后0.2 mm，中線右側(cè)旁開3 mm處，在顱骨表面鉆孔，將微量注射器調(diào)整至鉆孔處。取血前將鼠尾放在40 ℃溫水中5 min，消毒后距末端0.5 cm處剪斷，讓鼠尾血自然滴下取血，用微量注射器取大鼠自體不凝血50 μL，在立體定位儀引導下向尾狀核注入自體不凝血；緩慢進針6 mm，以25 μL/min速度2 min內(nèi)注入50 μL血液；留針10 min，緩慢出針，用骨蠟封閉顱骨上的鉆孔，縫合皮膚。以上均按無菌操作原則進行。假手術組除不注血外，其余操作同ICH組。

1.2.3 取材

各組大鼠分別按實驗設計于造模后1、2、3、5、7d取材。每組動物每個時間點各取2只大鼠麻醉處死后迅速打開胸腔，暴露心臟，剪開右心房，于心尖部剪開左心室，插管至主動脈，快速注100 mL生理鹽水沖洗后，再以4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取血腫周圍直徑5 mm厚腦組織，以4%多聚甲醛固定24 h。常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、連續(xù)冠狀切片，切片厚度5 um，切片貼附于預處理的載玻片上，用前脫蠟至水，行細胞凋亡檢測、Bcl-2與Bax蛋白免疫組化染色。

1.2.4 指標測定

在高倍物鏡下， 每張切片中隨機選取出血灶邊緣相互不重疊的5個視野，計數(shù)高倍（400×）鏡下細胞凋亡、Bcl-2和Bax蛋白的陽性細胞數(shù)。

1.2.4.1 細胞凋亡檢測

采用細胞凋亡-Hoechst［7，8］ ，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，試劑由碧云天生物技術研究所提供。熒光顯微鏡下正常細胞呈正常藍色，而凋亡細胞為細胞核呈致密濃染，或呈碎快狀致密濃染，顏色有些發(fā)白。

1.2.4.2 Bcl-2及Bax蛋白檢測

采用免疫組化SP法，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，鼠抗Bcl-2和Bax多克隆抗體，工作濃度分別為1∶100和1∶75，均為公司武漢博士德公司產(chǎn)品。Bcl-2和Bax蛋白以細胞胞質(zhì)呈棕黃色著色為陽性細胞。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較均采用方差分析及q檢驗。全部統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 細胞凋亡

假手術組凋亡細胞在各時間點均有少量表達，ICH組凋亡細胞第1 天開始明顯增多，第2天達到高峰，之后逐漸減少，第7天仍有凋亡細胞存在，逐淤化痰湯組與ICH組比較凋亡細胞數(shù)各時間點均有顯著降低(P

2.2 Bcl-2與Bax蛋白表達的變化

在假手術組Bcl-2與Bax蛋白表達陽性細胞數(shù)較低；ICH組與假手術組相比，Bcl-2、Bax蛋白表達陽性細胞數(shù)均明顯增加（P

3 討論

細胞凋亡是不同于細胞壞死的一種細胞死亡形式，其過程受一系列相關基因的調(diào)控。其中Bcl-2家族在凋亡調(diào)控基因中位于重要地位，Bcl-2蛋白是一種膜合蛋白，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的神經(jīng)保護性蛋白，它存在于細胞的線粒體、核膜等處，主要生理功能抑制細胞凋亡、延長細胞壽命；通過阻止細胞凋亡的早期環(huán)節(jié)而發(fā)揮作用，能夠阻止或降低染色質(zhì)濃縮和DNA裂解的發(fā)生，它的表達是抑制細胞凋亡的關鍵步驟；Bax蛋白是Bcl-2的同源蛋白，具有促進細胞凋亡的作用，并具有抑制Bcl-2的效應。在正常細胞中存在著Bax與Bcl-2微量表達，細胞胞漿中Bax- Bax同源二聚體可促進細胞凋亡，Bcl-2- Bax異源二聚體則抑制細胞凋亡，細胞是否發(fā)生凋亡，依賴于這些分子的相對濃度。Bax/Bcl-2比值增大促進凋亡，而Bax/Bcl-2比值減小抑制凋亡。

本實驗結(jié)果顯示：ICH組Bcl-2、Bax蛋白表達均比較高，這可能是出血過程中損傷和抗損傷作用相互拮抗的一種表現(xiàn)，Bcl-2受到某種抑制因素的作用，使Bax促凋亡作用最終占優(yōu)勢而導致細胞凋亡。而在逐淤化痰湯組Bcl-2蛋白表達顯著增加，Bax蛋白表達顯著降低，說明逐淤化痰湯有上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax蛋白表達的作用，并因此而減少腦出血后神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生。研究表明，腦出血后細胞凋亡的高峰在48～72 h，這種高峰與臨床上病情的繼發(fā)性加重的過程一致，故認為凋亡可能是腦出血后血腫周圍神經(jīng)細胞遲發(fā)性損傷的重要機制。

綜上所述，逐淤化痰湯作為中藥制劑在腦出血急性期應用具有上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax蛋白表達以減少細胞凋亡的作用。本實驗再次證明實驗性腦出血大鼠在腦出血急性期應用活血化淤中藥是安全、有效的，為今后臨床上在腦出血急性期應用活血化淤中藥提供實驗依據(jù)。

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