導(dǎo)語：如何才能寫好一篇生物信息學(xué)的研究進(jìn)展，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

【關(guān)鍵詞】 生物黃酮; 心血管作用; 消化系統(tǒng)作用

近年來生物黃酮化合物的研究取得了很多可喜成果，尤其在心血管、消化系統(tǒng)以及鎮(zhèn)痛作用方面。本文就近年來相關(guān)研究及其臨床應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 心血管系統(tǒng)

1.1 沙苑子總黃酮沙苑子總黃酮(total flavonoid fractiono Astra)是從豆科植物扁莖黃芪的干燥成熟種子中分離而得， 早在20世紀(jì)80年代尹鐘洙等［1］曾初步觀察到靜脈注射沙苑子水煎劑及其總黃酮可引起血壓明顯下降， 李景新等［2］報(bào)道沙苑子總黃酮對(duì)腎血管性高血壓大鼠（RHR）有明顯降壓作用， 其機(jī)理可能與其降低血管緊張素（Ang）水平有關(guān)。吳捷等［3］認(rèn)為沙苑子總黃酮能抑制心肌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流。

1.2 沙棘總黃酮(TFH)沙棘在許多藥理作用方面與銀杏相近，而銀杏（TFG）抗心腦缺血作用已在臨床上廣泛應(yīng)用，王立群等［4］實(shí)驗(yàn)表明，TFH和TFG對(duì)離體大鼠工作心臟缺血后心功能及血流動(dòng)力學(xué)各指標(biāo)有不同程度的改善作用，主要表現(xiàn)在能明顯減輕缺血后LVPSP，+dp/dtmax下降，TFH作用明顯優(yōu)于TFG。

黃酮具有抗氧化、消除自由基作用。吳英等［5］研究表明沙棘總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)能明顯減輕缺血再灌損傷區(qū)超微結(jié)構(gòu)的病理改變，顯著提高大鼠心肌組織SOD活性并減少M(fèi)DA的生成。TFH對(duì)大鼠心肌缺血再灌損傷的保護(hù)作用可能與提高自由基清除酶活性及抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。

1.3 羊藿總黃酮許蘭之等［6］研究了羊藿總黃酮(TFE)對(duì)腎上腺素能受體阻斷作用，發(fā)現(xiàn)TFE選擇性阻斷離體及整體動(dòng)物心肌β1受體，對(duì)氣管β2受體和血管平滑肌α受體無阻斷的作用， 此研究為臨床應(yīng)用羊藿治療冠心病心絞痛提供了理論依據(jù)。

1.4 水杉總黃酮程虹等［7］報(bào)道用水杉總黃酮10 mg/kg ip可推遲烏頭堿誘發(fā)的大鼠心律失常的出現(xiàn)時(shí)間，縮短持續(xù)時(shí)間；提高氯化鈣誘發(fā)大鼠心律失常的閾劑量;增加哇巴因誘發(fā)豚鼠心律失常的用量；還能對(duì)抗心肌缺血復(fù)灌所致的大鼠心律失常，表明水杉總黃酮具有廣泛的抗心律失常作用。水杉總黃酮能明顯減少甲狀腺素所致心臟肥厚大鼠心臟重量，縮短心肌纖維直徑，減少心室蛋白質(zhì)及RNA含量，降低心室Na+-K+ATP酶及Na+-Ca2+ATP酶活性， 表明水杉總黃酮對(duì)甲狀腺素所致大鼠心臟肥厚具有抑制作用， 提示水杉總黃酮逆轉(zhuǎn)心衰致心肌肥厚有一定的意義［8］。

2 消化系統(tǒng)

2.1 黃芩莖葉總黃酮黃芩莖葉總黃酮可劑量依賴性地抑制膽鹽的吸收(P＜0.01)，其與考來烯胺的抑制膽鹽吸收的作用相比，沒有顯著性差異(P＞0.05)。提示抑制膽鹽的吸收可能是黃芩莖葉總黃酮調(diào)血脂作用機(jī)理之一。黃芩莖葉總黃酮應(yīng)用于降血脂和防治冠心病可能會(huì)優(yōu)于考來烯胺。但黃芩莖葉總黃酮抑制膽鹽吸收的同時(shí)，脂溶性維生素的吸收會(huì)不會(huì)受到抑制尚須進(jìn)一步研究［9］。

我室近來研究表明皺皮木瓜提取物依劑量抑制胃腸運(yùn)動(dòng); 抑制回腸自發(fā)性收縮反應(yīng)和非競爭性拮抗乙酰膽堿誘導(dǎo)胃底平滑肌收縮的量效曲線;同時(shí)能減弱Ca2+所致兔回腸收縮， 木瓜提取物對(duì)胃腸平滑肌收縮的松弛與抗鈣作用有關(guān)［10］。提示皺皮木瓜具有解痙作用。

3 鎮(zhèn)痛抗炎

3.1 銀杏葉總黃酮

在小鼠扭體模型上，皮下注射銀杏葉總黃酮20～80 mg/kg，可顯著減少小鼠扭體數(shù)，并且呈劑量依賴關(guān)系;在小鼠熱板模型上，皮下注射和側(cè)腦室注射銀杏葉總黃酮均可顯著地延長小鼠舔足潛伏期，結(jié)果表明銀杏葉總黃酮有明顯鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用可能有中樞機(jī)制的參與［11］。

3.2 蘆丁宋必衛(wèi)等［12］對(duì)蘆丁的鎮(zhèn)痛作用研究結(jié)果表明蘆丁(6.25～100 mg/kg，ip)呈劑量依賴性的抑制小鼠扭體反應(yīng)；蘆丁(50～100 mg/kg，ip)明顯提高小鼠嘶叫刺激閥值，顯著延長小鼠熱板舔足反應(yīng)潛伏期，表明蘆丁有鎮(zhèn)痛作用。其鎮(zhèn)痛作用比阿斯匹林強(qiáng)， 但比嗎啡弱。

3.3 木瓜野木瓜系木通科野木瓜屬植物，具有祛風(fēng)止痛功能。野木瓜對(duì)髓鞘和軸突膜有親和力，可引起髓鞘和軸突膜結(jié)構(gòu)的變化，從而導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯［13］。我室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：資木瓜提取物對(duì)醋酸、溫度所致小鼠疼痛有較好的鎮(zhèn)痛作用，但對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹消腫作用很弱［14］。

3.4 蕎麥葉總黃酮蕎麥葉總黃酮(TFBL)能明顯減輕肉芽腫的形成，降低毛細(xì)血管通透性和抑制耳腫，顯示TFBL具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用［15］。其機(jī)制可能與TFBL所含的主要成分蘆丁和槲皮素有關(guān)。據(jù)報(bào)道，槲皮素對(duì)12脂氧合酶的活性有很強(qiáng)的抑制作用，可影響花生四烯酸的代謝過程。蘆丁、槲皮素鎮(zhèn)痛機(jī)制還與鈣離子拮抗有關(guān) 。TFBL具有清除自由基，抗脂質(zhì)過氧化作用［16］，可能也參與抗炎作用，有待深入研究。蕎麥葉資源豐富，其提取的TFBL幾乎無毒，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

3.5 黃蜀葵花總黃酮(TFA)黃蜀葵花總黃酮TFA(ig或ip)可不同程度地抑制小鼠扭體反應(yīng)；TFA(140，280 mg/kg，ig)可使福爾馬林致小鼠疼痛的Ⅰ、Ⅱ相反應(yīng)明顯減輕，TFA(ip)對(duì)同側(cè)ip福爾馬林導(dǎo)致的疼痛可產(chǎn)生同樣抑制作用，但對(duì)側(cè)ip福爾馬林致小鼠疼痛無明顯影響；動(dòng)脈注射TFA 200 mg/kg可明顯減輕KCl誘發(fā)的家兔疼痛反應(yīng)；連續(xù)用藥可使TFA在小鼠跳躍實(shí)驗(yàn)中陽性率為0。以上研究結(jié)果表明TFA有一定的鎮(zhèn)痛作用且局部給藥有效，連續(xù)用藥無成癮性。TFA的鎮(zhèn)痛機(jī)制可能既不同于阿片類藥物，也不同于非甾體抗炎藥，是一個(gè)鎮(zhèn)痛機(jī)制值得進(jìn)一步探討的新型鎮(zhèn)痛藥物［17］。

3.6 蜂膠總黃酮(TFP)蜂膠總黃酮具有廣泛的生物活性如鎮(zhèn)痛作用等。注射TFP后能減少小鼠扭體次數(shù)。熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明TFP可延長小鼠舔足潛伏期，即延緩疼痛反應(yīng)。甲醛致痛模型結(jié)果表明，注射TFP后在第一時(shí)相對(duì)小鼠疼痛反應(yīng)無明顯影響，但可顯著降低第二時(shí)相的疼痛反應(yīng)。說明TFP對(duì)炎癥所致疼痛反應(yīng)有明顯鎮(zhèn)痛作用。icv TFP低劑量(為ip給藥劑量的1/20，即5 mg/kg)時(shí)，即可延長溫浴致小鼠縮尾反應(yīng)潛伏期，提示TFP對(duì)小鼠具有中樞性鎮(zhèn)痛作用。已知NO在外周和中樞中以不同水平參與痛覺的調(diào)節(jié)。高劑量TFP在抑制小鼠熱板反應(yīng)時(shí)能降低小鼠腦組織NO的含量，提示TFP鎮(zhèn)痛作用可能與抑制小鼠腦組織中NO的釋放有關(guān)；另外，ip TFP在抑制小鼠熱板反應(yīng)同時(shí)，可降低腦組織、血清中MAD含量，提示TFP的鎮(zhèn)痛作用與抑制自由基及其過氧化物產(chǎn)生也有一定關(guān)系。PEGz是一種非常重要的疼痛介質(zhì)之一，PEG 的外周致痛作用早已明確。ip TFP可降低腦組織和血清中的PEGz含量，提示TFP的鎮(zhèn)痛作用與抑制PEG 合成也有一定關(guān)系。TFP在多種疼痛動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛作用，并可能通過降低腦組織中NO，MAD，PEG 含量和血中的MAD，PEG 含量而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。至于其確切的鎮(zhèn)痛機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究［18］。

4 其他

金絲桃苷、蕓香苷及槲皮素等有良好的鎮(zhèn)痛作用［19］，其作用機(jī)制與Ca2+拮抗有關(guān)，尤其是Hyp不僅在多種全身鎮(zhèn)痛模型上有作用，而且在兔隱神經(jīng)放電，兔耳K+皮下滲透等局部致痛模型上更有良好的局部鎮(zhèn)痛作用［20］，其作用機(jī)制與嗎啡和阿斯匹林皆不同，系一新型的鎮(zhèn)痛藥。

綜上所述，生物總黃酮來源廣泛，具有鎮(zhèn)痛消炎等多種藥理作用，有的甚至在臨床上得到廣泛應(yīng)用，是一大類值得進(jìn)一步研究和開發(fā)的藥物。

參考文獻(xiàn)

［1］Yin ZZ，Chen SH，Ma BB.Pharmacological studies of totalFlavonoid fraction of Astragalus complanatus［J］.R. Brown. Pharmacol Clin Chin Mater Med，1988，4(4)：26.

［2］李景新，薛 冰，陳連璧，等.沙苑子總黃酮對(duì)高血壓大鼠的降壓作用及血管緊張素含量的影響［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2002， 16（5）：336.

［3］吳 捷，于曉江，馬 欣，等.沙苑子總黃酮對(duì)豚鼠心室肌和培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞電生理作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，1994，15（4）：343.

［4］王立群，鄭金生.沙棘總黃酮(TFH)與銀杏總黃酮(TFG)心血管藥效學(xué)的對(duì)比研究［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2002，5（12）：1205.

［5］吳 英，王秉文，王 毅，等. 沙棘總黃酮對(duì)大鼠心肌再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，1997，13(1)：53.

［6］許蘭之，陳維寧. 羊藿總黃酮對(duì)腎上腺素β1受體的特異性阻斷作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，1994，10(4)：311.

［7］程 虹， 劉惟莞，陳 翔，等.水杉總黃酮抗實(shí)驗(yàn)性心律失常的作用［J］.湖北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，20（1）：28.

［8］程 虹，劉惟莞，屠治東，等. 水杉總黃酮對(duì)甲狀腺素所致大鼠心臟肥厚的抑制作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)， 2000，16(3):277.

［9］周崇坦，馮 軍，劉朝暉 ，等.黃芩莖葉總黃酮對(duì)離體大鼠回腸膽鹽吸收的影響［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2003，32（12）：1093.

［10］楊興海，柳 蔚，錢京萍，等.資木瓜乙醇提取物對(duì)胃腸平滑肌的實(shí)驗(yàn)研究［J］.四川中醫(yī)，2004，22(3):116.

［11］陳志武，方 明，馬傳庚，等.銀杏葉總黃酮的鎮(zhèn)痛作用［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，32(1):15.

［12］宋必衛(wèi)，等.蘆丁鎮(zhèn)痛作用［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995；30(3)：177.

［13］葉文博，張慧綺，金榮華，等.野木瓜皂甙對(duì)大鼠神經(jīng)髓鞘和軸突膜的作用［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2003，19(3)：311.

［14］柳蔚，楊興海，錢京萍，等. 資木瓜乙醇提取物鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 四川中醫(yī)，2004，22(8):6.

［15］王元福.甜蕎麥葉總黃酮鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2004，38（11）：55.

［16］韓淑英，朱麗莎，劉淑梅，等．蕎麥葉總黃酮調(diào)血脂及抗脂質(zhì)過氧化作用［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2002，5(7)：711.

［17］范 麗，董六一，陳志武，等.黃蜀葵花總黃酮鎮(zhèn)痛作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2003；19(1)：12.

［18］張 波，王東風(fēng)，王 爽，等. 蜂膠總黃酮鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制研究［J］.中國藥房，2005，16（19）：1458.

［19］宋必衛(wèi)，田 薇，劉穎雪，等.槲皮素鎮(zhèn)痛作用的研究［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，29：168.

篇2

關(guān)鍵詞：功能基因組；高通量數(shù)據(jù)；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：Q933 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）10-0190-01

功能基因組學(xué)（后基因組學(xué)），是在結(jié)構(gòu)基因組所提供的豐富的高通量信息資源以及大量各類生成產(chǎn)物的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因組學(xué)的子學(xué)科。其通過在功能基因組水平或功能系統(tǒng)水平上全面地分析基因的功能，發(fā)展和提出了多種實(shí)驗(yàn)手段和分析方法，使得生物學(xué)的研究對(duì)象由單一基因或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)為多個(gè)基因或蛋白質(zhì)組成的系統(tǒng)，進(jìn)而得到關(guān)于基因表達(dá)、調(diào)控、功能以及生物的生長、發(fā)育的相關(guān)規(guī)律。

1 差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT―PCR）技術(shù)是由Liang和Pardee等提出的，以PCR和聚丙烯酞胺凝z電泳為基礎(chǔ)的功能基因組學(xué)的傳統(tǒng)方法。該方法的基本原理是：以1對(duì)細(xì)胞（或組織） 的總RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為模板，利用PCR的高效擴(kuò)增，通過5’端和3’端引物的合理設(shè)計(jì)和組合，將細(xì)胞（或組織） 中表達(dá)的基因片段直接顯示在DNA測序膠上，從而找出1對(duì)細(xì)胞（或組織）中表達(dá)有差異的cDN斷。DDRT―PCR具有周期短，功能多，靈敏度高，所需RNA的量較少并且重復(fù)性較高等優(yōu)點(diǎn)。但是，在實(shí)際施行過程中， DDRT―PCR技術(shù)存在著假陽性率高、凝膠中單條cDNA帶成分不均一、所獲cDNA僅代表mRNA 3’UTR（非翻譯區(qū)）、一些低拷貝數(shù)mRNA不能有效呈現(xiàn)等問題。[1]

2 基因表達(dá)序列分析

基因表達(dá)序列分析（SAGE）是Velculescu等人建立的一種快速高效地分析轉(zhuǎn)錄物的實(shí)驗(yàn)方法。其理論依據(jù)是：基因組中95%的基因可以由來自cDNA 3’端特定位置的一段9―11bp長的序列加以區(qū)分。這一段特異的基因序列被記作SAGE標(biāo)簽?；虮磉_(dá)序列分析通過對(duì)cDNA制備SAGE標(biāo)簽，然后將這些標(biāo)簽串聯(lián)起來并對(duì)其進(jìn)行測定，可以顯示出各SAGE標(biāo)簽所代表的基因在特定的組織中是否有表達(dá)，同時(shí)還可以將SAGE標(biāo)簽所出現(xiàn)的頻率作為其所代表的基因表達(dá)程度的指標(biāo)。但是，應(yīng)用SAGE技術(shù)有一個(gè)重要前提條件：GenBank中必須有某一物種足夠多的DNA序列的資料（特別是EST序列的資料）。[2]

3 微陣列分析

DNA微陣列（microarray assay）技術(shù)包括cDNA微陣列和DNA芯片（DNA chip）兩種方法，這兩種方法的原理相同。首先是在固相表面合成成千上萬個(gè)寡核苷酸“探針”（cDNA、EST或基因特異的寡核苷酸），該過程會(huì)用到光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平版印刷和固相表面化學(xué)合成等技術(shù)。接著將寡核苷酸“探針”與來自不同細(xì)胞、組織或整個(gè)器官的用放射性同位素或熒光物標(biāo)記的DNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA進(jìn)行雜交。最后對(duì)每個(gè)雜交點(diǎn)進(jìn)行定量分析。定量分析的結(jié)果可以用于DNA測序、DNA突變和多態(tài)性分析以及對(duì)同一組織細(xì)胞在不同狀態(tài)下或在同一狀態(tài)下多種組織細(xì)胞基因表達(dá)水平的差異的檢測，還可以發(fā)現(xiàn)新的致病基因或疾病相關(guān)基因等。微陣列分析的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)對(duì)大量的基因，甚至是整個(gè)基因組的基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析，并且在核苷酸雜交技術(shù)的各個(gè)方面應(yīng)用。其在同時(shí)比較同一組織在不同狀態(tài)下或各組織之間DNA序列分析以及基因的表達(dá)狀況等方面具有極大的優(yōu)越性。

4 反義RNA分析

反義RNA是能與靶RNA互補(bǔ)配對(duì)的，用來定點(diǎn)分析某一段DN段（基因）功能的小分子RNA。反義RNA分析即是利用反義RNA來進(jìn)行功能基因組分析的方法。該方法首先分離基因片段的mRNA，合成其mRNA的互補(bǔ)RNA（反RNA）。然后給反RNA加上基因表達(dá)必需的元件（如啟動(dòng)子等），接著插入T-DNA。將其轉(zhuǎn)化到植株中，那么合成的基因就會(huì)在植株中表達(dá)，并表現(xiàn)出相應(yīng)性狀。因?yàn)榉戳xRNA與靶RNA堿基配對(duì)的結(jié)合方式，反義RNA可以在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上對(duì)基因表達(dá)加以調(diào)控。

5 蛋白質(zhì)組分析

蛋白質(zhì)組分析方法主要涉及兩個(gè)步驟：蛋白質(zhì)的分離和蛋白質(zhì)的鑒定。用于蛋白質(zhì)分離的技術(shù)主要是雙向凝膠電泳（2-dimensional gel electrophoresis，2-DE），其原理是細(xì)胞抽提物在電泳過程中蛋白質(zhì)個(gè)體首先依據(jù)所帶電荷然后依據(jù)分子大小被分離。這種方法的最大缺點(diǎn)是重復(fù)性差，使得幾乎不能同來自其他實(shí)驗(yàn)室的資料進(jìn)行比較。

6 生物信息學(xué)

生物信息學(xué)將DNA和蛋白質(zhì)作為研究對(duì)象，以計(jì)算機(jī)等計(jì)算工具為基礎(chǔ)，發(fā)展更新各種軟件，收集、整理和儲(chǔ)存DNA和蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，并加以分析進(jìn)而發(fā)現(xiàn)藏在基因序列中的規(guī)律。應(yīng)用生物信息學(xué)可以對(duì)功能基因組研究過程中產(chǎn)生的高通量，高維度的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，應(yīng)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法，以計(jì)算機(jī)的快速運(yùn)算能力，找到功能基因組的相關(guān)信息。常應(yīng)用生物信息學(xué)將未知DNA序列與數(shù)據(jù)庫中收集的DNA序列進(jìn)行同源性比較，或應(yīng)用相關(guān)軟件進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列的同源性比較，以此來獲得未知DNA序列的功能信息。[3]

7 小結(jié)與展望

隨著發(fā)展，基因組學(xué)由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)向功能基因組學(xué)發(fā)展，由此也產(chǎn)生了大量應(yīng)用于功能基因組研究的工具和方法。這些方法從不同的角度和方向挖掘基因本身蘊(yùn)含的豐富信息資源。功能基因組學(xué)無論是應(yīng)用于獲取大量基因功能信息，亦或是針對(duì)特定基因的研究都取得了突破性的進(jìn)展，發(fā)展速度迅速。但隨著各類研究的不斷深入進(jìn)行，這些方法的精確性和準(zhǔn)確性會(huì)漸漸不再滿足條件，同時(shí)各項(xiàng)技術(shù)尚未解決的一些問題也會(huì)被放大，單個(gè)方法或技術(shù)可能難以對(duì)新的問題有較好的應(yīng)用。結(jié)合各種方法，揚(yáng)長避短，綜合應(yīng)用各種技術(shù)可以對(duì)功能基因組有更全面、深入的研究。[4]

功能基因組學(xué)的應(yīng)用十分廣泛，從動(dòng)物、植物到微生物群落分析都可以取得較好的研究成果，也可以應(yīng)用于醫(yī)藥、毒理等領(lǐng)域。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，將生物信息學(xué)應(yīng)用于功能基因組學(xué)，借助計(jì)算機(jī)強(qiáng)大的計(jì)算能力，功能基因組學(xué)將能取得更大的突破。

參考文獻(xiàn)

[1]趙錦榮，閻小君，蘇成芝.差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù)研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27（1）：28-32.

[2]常青山，余增亮.基因表達(dá)分析方法及其研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2002，（6）：27-31.

篇3

關(guān)鍵詞：生物信息學(xué)；合作式教學(xué)；教學(xué)模式；教學(xué)改革

作者簡介：劉慶坡（1976-），男，河北曲陽人，浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，副教授。（浙江 臨安 311300）

基金項(xiàng)目：本文系浙江農(nóng)林大學(xué)“農(nóng)學(xué)類核心課程教學(xué)團(tuán)隊(duì)”項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：TD1201）、浙江農(nóng)林大學(xué)研究生優(yōu)質(zhì)課程建設(shè)項(xiàng)目《生物信息學(xué)》的研究成果。

中圖分類號(hào)：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0079（2013）16-0110-02

生物信息學(xué)是20世紀(jì)90年代由多學(xué)科知識(shí)相互滲透、融合而興起的一門新興交叉學(xué)科，現(xiàn)已成為當(dāng)今生命科學(xué)和自然科學(xué)的重大前沿領(lǐng)域之一。[1]基于本學(xué)科在現(xiàn)代生命科學(xué)研究中的重要地位，現(xiàn)在國內(nèi)外許多高校都紛紛設(shè)置了生物信息學(xué)專業(yè)或開設(shè)了“生物信息學(xué)”課程。[2]為培養(yǎng)具有創(chuàng)新精神和創(chuàng)業(yè)能力的應(yīng)用型、復(fù)合型人才，浙江農(nóng)林大學(xué)近年來面向農(nóng)學(xué)等本科專業(yè)及作物、森林培育、林木遺傳育種等研究生專業(yè)開設(shè)了“生物信息學(xué)”選修課程。

生物信息學(xué)是理論概念與實(shí)踐應(yīng)用并重的學(xué)科，具有開放性、發(fā)展性、交叉性、綜合性、應(yīng)用性等特點(diǎn)。鑒于此，盡管國內(nèi)的生物信息學(xué)科學(xué)研究開展得如火如荼，但由于受到師資、教材、授課對(duì)象、教學(xué)條件、教學(xué)法等因素限制，[3，4]開設(shè)該課程的高校尚未真正形成一套成熟的、科學(xué)的教學(xué)體系。近年來，各高校根據(jù)自身特點(diǎn)，不斷探索將CM法、PBL法、探究性、啟發(fā)性教學(xué)、雙語教學(xué)等教學(xué)法與手段引入課堂，并革新教學(xué)內(nèi)容及考核方式等，取得了不錯(cuò)的課程教學(xué)效果。[3，5-9]

現(xiàn)代教學(xué)改革與實(shí)踐證明，在教學(xué)過程中必須要突出“學(xué)生是教學(xué)活動(dòng)的主體”，既要注意張揚(yáng)學(xué)生“個(gè)性”，更要強(qiáng)化學(xué)生團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)及創(chuàng)新、創(chuàng)業(yè)能力培養(yǎng)，以保證人才培養(yǎng)質(zhì)量。楊瑞等[10]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在大部分學(xué)生比較“獨(dú)”，不愿意與人合作，這導(dǎo)致學(xué)生間人際關(guān)系淡漠，學(xué)習(xí)、做事效率低下。隨著各種“組學(xué)”計(jì)劃的開展，產(chǎn)生了數(shù)以萬、億計(jì)的序列數(shù)據(jù)，生物信息學(xué)得到了空前發(fā)展。在這種情況下，傳統(tǒng)的“填鴨式”、“布道式”教學(xué)模式已與當(dāng)前社會(huì)快速發(fā)展的局面格格不入，迫切需要變革。合作式教學(xué)法是20世紀(jì)70年代興起于美國的一種參與式或協(xié)作式教學(xué)法，它以學(xué)生為中心，在教師恰當(dāng)?shù)慕M織、引導(dǎo)和有效調(diào)控下，使學(xué)生成為教學(xué)過程中的積極成分，通過“師生”、“生生”積極合作完成教學(xué)任務(wù)。[11]為激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性和教學(xué)參與熱情，在采用啟發(fā)式、案例式和研討式教學(xué)基礎(chǔ)上，嘗試將合作式教學(xué)法引入“生物信息學(xué)”教學(xué)課堂。

一、開展合作式教學(xué)的必要性

“團(tuán)結(jié)就是力量“、“獨(dú)學(xué)而無友，則孤陋而寡聞”、“三人行必有吾師”等至理名言很好地闡釋了團(tuán)隊(duì)合作的重要性與必要性。浙江農(nóng)林大學(xué)于2008年開始在農(nóng)學(xué)、種子科學(xué)與工程等專業(yè)開設(shè)“生物信息學(xué)”課程。農(nóng)學(xué)是生命科學(xué)領(lǐng)域的重要學(xué)科之一，基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展極大地促進(jìn)了農(nóng)學(xué)等生物科學(xué)研究的進(jìn)步。因此，系統(tǒng)學(xué)習(xí)并掌握生物信息學(xué)的基本知識(shí)、基本理論和基本技能，不僅是學(xué)校培養(yǎng)“兩創(chuàng)型”高素質(zhì)農(nóng)業(yè)科技人才的需要，也是國家發(fā)展現(xiàn)代高新農(nóng)業(yè)對(duì)農(nóng)學(xué)相關(guān)專業(yè)學(xué)生的基本要求。

但是，經(jīng)過幾年教學(xué)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)相關(guān)專業(yè)學(xué)生學(xué)習(xí)“生物信息學(xué)”課程主要存在以下2個(gè)問題：

一是學(xué)生的重視程度不夠。有些學(xué)生對(duì)該課程的認(rèn)識(shí)比較偏頗，不清楚其教學(xué)目的及學(xué)后有何用處，因而學(xué)習(xí)目的不明確，學(xué)習(xí)動(dòng)力不足。

二是學(xué)生的知識(shí)水平參差不齊。由于本課程理論性與實(shí)踐性并重，前后知識(shí)點(diǎn)的銜接相對(duì)比較緊湊，且生物信息學(xué)相關(guān)網(wǎng)站、數(shù)據(jù)庫和軟件等均使用英文，有些學(xué)生數(shù)理化、計(jì)算機(jī)和英語等基礎(chǔ)知識(shí)不太扎實(shí)，在不能有效掌握某些知識(shí)點(diǎn)后，久而久之會(huì)產(chǎn)生厭學(xué)情緒。因此，采用教師講授、預(yù)設(shè)問題，學(xué)生提問，學(xué)生組隊(duì)分析和解決問題，教師點(diǎn)評(píng)加總結(jié)等“師與生”、“生與生”合作式教學(xué)，不僅可以使學(xué)生明晰本課程的學(xué)習(xí)目的，增強(qiáng)他們的參與意識(shí)與學(xué)習(xí)熱情，更重要的是，可以使學(xué)生之間優(yōu)勢互補(bǔ)、互通有無、集思廣益，達(dá)到“以活動(dòng)促合作，以合作促發(fā)展”的目的。

二、合作式教學(xué)的組織與實(shí)施

1.教學(xué)目標(biāo)與設(shè)計(jì)

（1）教學(xué)目標(biāo)。根據(jù)現(xiàn)代教育教學(xué)規(guī)律，以“生物信息學(xué)”優(yōu)質(zhì)課程建設(shè)為依托，以課堂建設(shè)為抓手，以培養(yǎng)“兩創(chuàng)型”高素質(zhì)應(yīng)用人才為根本任務(wù)，以多媒體、網(wǎng)絡(luò)、教學(xué)平臺(tái)為載體，深化改革，通過師生、生生間相互影響與合作，突顯學(xué)生教學(xué)主體地位，切實(shí)提高課堂教學(xué)效果。

（2）教學(xué)設(shè)計(jì)。因?yàn)椤吧镄畔W(xué)”課程涉及的知識(shí)點(diǎn)比較多，而課時(shí)有限，所以正規(guī)的合作式教學(xué)法即小講課加分組活動(dòng)不太適合。根據(jù)“生物信息學(xué)”課程性質(zhì)及農(nóng)學(xué)相關(guān)專業(yè)學(xué)生的學(xué)習(xí)特點(diǎn)，本課程采用在教師教學(xué)過程中加入合作式教學(xué)法元素的形式進(jìn)行教學(xué)。教學(xué)過程中，避免過多講授數(shù)據(jù)庫開發(fā)、軟件算法等純理論性內(nèi)容，堅(jiān)持以解決生物學(xué)問題為主線，講授解決問題的思路與方法；堅(jiān)持以教師為主導(dǎo)，以學(xué)生為主體，結(jié)合教師自身科研工作及本學(xué)科領(lǐng)域最新研究進(jìn)展等案例教學(xué)，組織、引導(dǎo)和啟發(fā)學(xué)生開展自主與合作學(xué)習(xí)，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考、分析問題和解決問題的能力及團(tuán)隊(duì)合作精神與創(chuàng)造力。

2.教學(xué)組織與實(shí)施

合作式教學(xué)的關(guān)鍵是調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，使其積極參與其中，即教師應(yīng)用靈活多樣的教學(xué)手段，鼓勵(lì)學(xué)生積極參與教學(xué)過程，并通過實(shí)踐演練、課堂報(bào)告、研討、課上和課下實(shí)時(shí)交流等為載體強(qiáng)化教學(xué)效果。經(jīng)過近幾年教學(xué)實(shí)踐，總結(jié)調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)積極性的基本要素，主要圍繞以下幾方面開展合作式教學(xué)：

（1）實(shí)例為導(dǎo)，強(qiáng)化練習(xí)。在講授完每個(gè)知識(shí)點(diǎn)后，教師結(jié)合自己的科研工作在網(wǎng)絡(luò)上進(jìn)行案例示范演示，然后由學(xué)生兩兩臨時(shí)搭配組隊(duì)上臺(tái)操作，完成規(guī)定任務(wù)，鞏固所學(xué)知識(shí)。比如在講解完“用關(guān)鍵詞或詞組檢索生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫”后，在2個(gè)自然班中分別臨時(shí)組建4個(gè)兩人小組，每個(gè)小組中一人負(fù)責(zé)出題，另一人負(fù)責(zé)解題，然后負(fù)責(zé)出題的學(xué)生對(duì)解題過程及答案進(jìn)行點(diǎn)評(píng)，最后其他同學(xué)和教師進(jìn)行點(diǎn)評(píng)及總結(jié)，加深了學(xué)生對(duì)相關(guān)知識(shí)點(diǎn)的理解。

（2）預(yù)設(shè)問題，開放教學(xué)。在講授新的知識(shí)點(diǎn)前，教師預(yù)先設(shè)置知識(shí)點(diǎn)相關(guān)問題，讓學(xué)生課后自學(xué)和探究思考，期間學(xué)生之間討論，亦可請教教師。比如在講到系統(tǒng)進(jìn)化部分時(shí)，布置思考題“有哪些證據(jù)證明人類是從非洲走出來的？”或者教師預(yù)設(shè)一些本學(xué)科熱點(diǎn)問題或尚未解決的問題（無固定答案），讓學(xué)生自由組隊(duì)，通過課下查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料、獨(dú)立思考及組內(nèi)成員討論等探討相關(guān)問題的解題思路與方法，從而激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)熱情。比如“蛋白質(zhì)和DNA的進(jìn)化問題，是先有‘雞’還是先有‘蛋’？”“除了農(nóng)學(xué)及醫(yī)學(xué)外，生物信息學(xué)還有哪些應(yīng)用領(lǐng)域？”等等。學(xué)生帶著問題去查找資料，通過集體討論達(dá)成共識(shí)。在各小組匯報(bào)時(shí)，首先由組內(nèi)成員做補(bǔ)充說明，然后由其他組同學(xué)進(jìn)行質(zhì)疑。在相互質(zhì)疑、討論中，使學(xué)生獲取靈感，擴(kuò)大視野。

（3）角色互換，學(xué)生提問。改變過去教師“一言堂”教學(xué)局面，鼓勵(lì)學(xué)生隨時(shí)就相關(guān)問題進(jìn)行提問，由學(xué)生或教師解答，真正做到師生互動(dòng)，啟發(fā)學(xué)生思考，活躍課堂氣氛。

（4）注重實(shí)踐，關(guān)注效果。因?yàn)楸緦W(xué)科知識(shí)點(diǎn)間連貫性較強(qiáng)，所以在講授2-3個(gè)知識(shí)點(diǎn)后，教師要布置綜合性的題目，由學(xué)生組隊(duì)在網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室里現(xiàn)場完成教學(xué)任務(wù)。學(xué)生組隊(duì)是半自由型的，即教師提出一定要求，在此前提下學(xué)生組隊(duì)，以避免“優(yōu)優(yōu)”或“差差”組合等情況發(fā)生，使學(xué)生間做到優(yōu)勢互補(bǔ)，且既有分工，又有合作。比如，在講完系統(tǒng)進(jìn)化樹重構(gòu)章節(jié)后，要求學(xué)生根據(jù)研究興趣每5人一組，完成同源基因的搜集、多序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建、分析及解讀等所有環(huán)節(jié)，然后各小組進(jìn)行課堂報(bào)告。學(xué)生組隊(duì)必須滿足教師提出的要求，即成員必須分別來自不同的自然班且成員間學(xué)習(xí)成績差異要比較明顯；成員中最好有英語、計(jì)算機(jī)或生物學(xué)成績較好的學(xué)生；成員間必須有分工，分別負(fù)責(zé)查資料、制作PPT、匯報(bào)等，且又必須通力合作，共同完成任務(wù)等，從而激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新思維和創(chuàng)新意識(shí)，增強(qiáng)學(xué)生的團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)與協(xié)作能力。

（5）全員參與，分類評(píng)價(jià)。本課程為專業(yè)選修課。課程成績以平時(shí)成績70%，期末考試（開卷）30%來計(jì)算。平時(shí)成績主要由學(xué)生出勤、課堂參與度、實(shí)驗(yàn)報(bào)告、課堂報(bào)告等組成，其中實(shí)驗(yàn)及課堂報(bào)告環(huán)節(jié)均以小組形式進(jìn)行，重點(diǎn)考查學(xué)生的學(xué)習(xí)態(tài)度和完成質(zhì)量等。在涉及到分組考核時(shí)，要求小組間分別評(píng)分，教師采取一定措施保證各組間打分相對(duì)客觀、公平，實(shí)現(xiàn)全員參與評(píng)價(jià)。

（6）實(shí)時(shí)溝通，解惑釋疑。學(xué)生課后可通過課程網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(tái)或QQ、MSN、E-mail、手機(jī)短信等實(shí)時(shí)聊天、溝通工具，與教師及時(shí)交流自己的學(xué)習(xí)心得或?qū)W習(xí)中遇到的困難等，教師不僅可為學(xué)生解惑釋疑，而且還有利于掌握學(xué)生對(duì)本課程的學(xué)習(xí)情況。教師可據(jù)此及時(shí)調(diào)整授課方案，達(dá)到更好的教學(xué)效果。

3.教學(xué)效果與評(píng)價(jià)

經(jīng)在2010級(jí)2個(gè)自然班55名農(nóng)學(xué)專業(yè)學(xué)生中進(jìn)行合作式教學(xué)試點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，學(xué)生最終成績中最低72分，最高95分，平均為86.1±5.08分。經(jīng)T檢驗(yàn)分析，顯著高于27名2008級(jí)學(xué)生的平均成績（83.2±5.13分；p=0.023）。因此，在“生物信息學(xué)”課程開展以課堂活動(dòng)為特征的合作式教學(xué)，不僅活躍了課堂氣氛，增強(qiáng)了學(xué)生的參與意識(shí)，還極大地調(diào)動(dòng)了學(xué)生主動(dòng)學(xué)習(xí)的積極性，明顯提高了學(xué)習(xí)成績，培養(yǎng)了學(xué)生的科研創(chuàng)新能力和團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)?！敖虒W(xué)結(jié)合實(shí)際”、“講課時(shí)經(jīng)常會(huì)舉些有關(guān)知識(shí)的例子，很能提高同學(xué)的學(xué)習(xí)熱情”、“老師時(shí)常會(huì)講授有關(guān)的科學(xué)前沿知識(shí)，很能調(diào)動(dòng)同學(xué)積極性”、“注重培養(yǎng)學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力”、“上課與其他老師的方式不一樣，利于我們聽課”、“始終讓我保持上課興趣”、“上課有活力！”等是學(xué)生對(duì)“生物信息學(xué)”課程教學(xué)模式與教學(xué)效果的客觀評(píng)價(jià)。

三、結(jié)束語

生物信息學(xué)是一個(gè)不斷發(fā)展中的學(xué)科。實(shí)踐證明，只有緊跟學(xué)科發(fā)展步伐，及時(shí)更新、豐富教學(xué)內(nèi)容；堅(jiān)持“以生為本”，立足授課對(duì)象的實(shí)際需要，不斷調(diào)整和革新教學(xué)模式與教學(xué)方法，改進(jìn)和完善學(xué)科教學(xué)體系，才能穩(wěn)步提升本課程課堂教學(xué)效果，保證教學(xué)質(zhì)量，從而為我國農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化培養(yǎng)更多高素質(zhì)、強(qiáng)能力的應(yīng)用型人才。

參考文獻(xiàn)：

[1]張陽德.生物信息學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[2]程鋼.生物信息學(xué)課程教學(xué)改革和實(shí)踐[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，

2011，17（13）：191-193.

[3]張紀(jì)陽，劉偉，謝紅衛(wèi).生物信息學(xué)課程研究性教學(xué)的實(shí)踐與思考[J].高等教育研究學(xué)報(bào)，2011，34（4）：51-53.

[4]梁琛，張建海.農(nóng)科類生物信息學(xué)課程教學(xué)中存在的問題及對(duì)策[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2010，30（5）：136-138.

[5]張林，柴慧.CM教學(xué)法和PBL教學(xué)法的結(jié)合應(yīng)用研究——以醫(yī)學(xué)生物信息學(xué)為平臺(tái)[J].中國高等醫(yī)學(xué)教育，2012，（8）：116-117.

[6]郭艷芳，李金明.PBL教學(xué)法在醫(yī)學(xué)生物信息學(xué)實(shí)踐教學(xué)中的應(yīng)用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育，2011，13（11）：1007-1008.

[7]劉偉，張紀(jì)陽.“生物信息學(xué)”課程中研討式教學(xué)實(shí)踐[J].中國電力教育，2012，（23）：60-61.

[8]魏戰(zhàn)勇，高曉平.農(nóng)業(yè)院校生物信息學(xué)教學(xué)改革與探索[J].鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2011，31（4）：50-51.

[9]胡娜，常軍，徐玲.生物信息學(xué)教學(xué)改革與實(shí)踐[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（3）：1588-1589.

篇4

關(guān)鍵詞：品種真實(shí)性鑒定 分子標(biāo)記

1、農(nóng)作物品種真實(shí)性鑒定分子檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

目前在品種真實(shí)性鑒定中使用的主要分子檢測技術(shù)是分子標(biāo)記技術(shù)。自從1980年Botstein等首次提出RFLP作為遺傳標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜以來，分別出現(xiàn)了20多種分子標(biāo)記技術(shù)。目前在品種真實(shí)性鑒定中應(yīng)用到的分子標(biāo)記為RFLP、AFLP、RAPD以及SSR標(biāo)記技術(shù)。

1.1 RFLP技術(shù)是1974年Grodzicker發(fā)明，是以Southern雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)原理是檢測DNA由限制性內(nèi)切酶切后形成的DN段的大小差異。RFLP標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記量大，等位基因間共顯性可區(qū)分純合子和雜合子；缺點(diǎn)是工作量大，成本高，要求的DNA量大且純度要高。

1.2 AFLP技術(shù)是1993年Zabeau等發(fā)明，通過對(duì)基因組DNA酶切片段的選擇性擴(kuò)增來檢測DNA酶切片段長度的多態(tài)性。結(jié)合了限制酶切和PCR技術(shù)，可在一個(gè)反應(yīng)內(nèi)檢測大量的限制性片段，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。但是AFLP技術(shù)操作復(fù)雜，成本較高，并且該項(xiàng)技術(shù)受到專利保護(hù)，只能用于非盈利性的科學(xué)研究。

1.3 RAPD技術(shù)是Willims、Welsh、McClelland等分別獨(dú)立建立。用一種由10個(gè)核苷酸組成的隨機(jī)引物，采用PCR技術(shù)對(duì)基因組的幾個(gè)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生大小不同的DNA，即為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性。RAPD標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是僅需少量DNA，簡單快速，成本低；缺點(diǎn)是穩(wěn)定性差，重復(fù)性不好，顯性，不能鑒定雜合子。

1.4 SSR技術(shù)室根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的保守序列設(shè)計(jì)引物，用PCR來擴(kuò)增重復(fù)序列的多態(tài)性。SSR主要依賴于基本單元次數(shù)的變異，而這種變異在生物群體中是大量存在的。SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是具有大量的等位差異，多態(tài)性十分豐富，并且操作簡便，穩(wěn)定可靠。此外，maize GDB、PANZEA等數(shù)據(jù)庫不斷提供和共享SSR引物，主要農(nóng)作物如水稻等的基因組測序計(jì)劃已經(jīng)完成以及其他作物的基因組測序計(jì)劃將陸續(xù)實(shí)施，生物信息學(xué)軟件以及高通量分子技術(shù)的開發(fā)等都為SSR標(biāo)記在品種真實(shí)性鑒定上的應(yīng)用開拓了更廣闊的空間。

2、水稻、玉米、棉花、小麥及等主要農(nóng)作物品種真實(shí)性鑒定分子檢測技術(shù)研究進(jìn)展

2.1 水稻是我國的主要糧食作物，在品種真實(shí)性分子檢測技術(shù)研究方面經(jīng)過10多年的系統(tǒng)研究，目前已經(jīng)形成了國家及地方的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻所和作物所分別對(duì)參加水稻南、北方稻區(qū)國家水稻品種區(qū)域試驗(yàn)的材料構(gòu)建了DNA指紋圖譜，四川、重慶、遼寧、安徽等省市也分別對(duì)參加省區(qū)試和歷年推廣的水稻品種構(gòu)建了DNA指紋圖譜。

2.2 玉米品種真實(shí)性分子檢測技術(shù)研究中，北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心趙久然、王風(fēng)格等已經(jīng)建立了SSR技術(shù)鑒定玉米品種真實(shí)性的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)體系，并提出了SSR核心引物理論，已構(gòu)建2000多個(gè)玉米品種（或組合）和自交系標(biāo)準(zhǔn)指紋，初步形成DNA指紋庫的管理和查詢計(jì)算機(jī)管理系統(tǒng)。

2.3 相對(duì)于水稻和玉米，小麥和棉花品種真實(shí)性分子檢測技術(shù)的研究相對(duì)滯后，但也已取得了初步的進(jìn)展。小麥已經(jīng)建立部分品種的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。棉花SSR引物的開發(fā)正在快速進(jìn)行，僅在CMD上公布的引物已有9000多對(duì)，且仍在不斷的增加中，這為利用SSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行棉花DNA指紋圖譜的構(gòu)建和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

篇5

2006年，第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)病是目前我國肢體致殘的兩大主要原因之一，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脊髓灰質(zhì)炎、腦癱及交通事故等，而在這些關(guān)節(jié)病中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的致殘率高居首位。RA是我國常見的一種慢性致殘性自身免疫病，相關(guān)專家預(yù)計(jì)，目前我國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者超過440萬人。遺憾的是，大量患者未得到規(guī)范有效的治療。

張鵬，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究與發(fā)展中心執(zhí)行主任，師從我國著名骨科專家戴尅戎院士，主攻類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)理和治療。

作為知名骨科專家秦嶺教授領(lǐng)導(dǎo)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心的核心成員，張鵬博士研究團(tuán)隊(duì)以骨科炎癥性疾病為研究重點(diǎn)，從病因、發(fā)病機(jī)理、治療以及康復(fù)等方面進(jìn)行系統(tǒng)研發(fā)。以對(duì)發(fā)病機(jī)理的探討作為基礎(chǔ)研究提升水平的基石，以對(duì)該類疾病治療手段的創(chuàng)新以及相關(guān)產(chǎn)品或技術(shù)的臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化作為最高目標(biāo)，以服務(wù)廣大骨科患者作為宗旨，正在走一條具有自身特色的骨科轉(zhuǎn)化研發(fā)之路。

“老藥新用”，攻堅(jiān)類風(fēng)濕

張鵬曾在導(dǎo)師戴尅戎院士的指導(dǎo)下，在國際上首次驗(yàn)證了手術(shù)懸吊方式刺激迷走神經(jīng)進(jìn)而激活“膽堿能抗炎通路”對(duì)于RA模型早期炎癥發(fā)展的抑制作用。研究結(jié)果發(fā)表在SCI 期刊《Inflammation Research》上。隨后該論文陸續(xù)被《Nature Review Rheumatology》和《Nature Review Immunology》等高端雜志引用，截至目前該文章已被引用11次。

針對(duì)目前全球范圍內(nèi)新藥研發(fā)遇到“冷冬”的大環(huán)境，張鵬課題組聯(lián)合計(jì)算機(jī)化學(xué)及生物信息學(xué)相關(guān)的專家，通過計(jì)算機(jī)輔助藥物預(yù)測結(jié)合目前骨關(guān)節(jié)炎基礎(chǔ)研究中的最新成果，在臨床用藥中篩選具有治療RA及骨關(guān)節(jié)炎等疾病的藥物新功效，即“老藥新用”在骨關(guān)節(jié)炎癥中的應(yīng)用。

張鵬曾在《Inflammation Research》、《Therapeutic Advances in Musculoskeletal Disease》、《ScientificWorldJournal》等雜志發(fā)表文章，闡述了RA治療中的“老藥新用”策略：以膽堿能受體作為潛在的治療靶點(diǎn)，通過應(yīng)用最新的藥物靶點(diǎn)檢索手段—“蛋白質(zhì)折疊碼”技術(shù)，在臨床用藥中篩選新的抗風(fēng)濕功效，進(jìn)而通過臨床前實(shí)驗(yàn)手段（體外細(xì)胞學(xué)、動(dòng)物模型體內(nèi)）驗(yàn)證其生物學(xué)特性，從而提出了一整套基于現(xiàn)代生物信息學(xué)最新技術(shù)的“老藥新用”策略，并在RA治療中進(jìn)行具體實(shí)施。

目前，基于神經(jīng)內(nèi)科用藥GTS-21（膽堿能受體激動(dòng)劑）探討其治療RA的研究已經(jīng)獲得國家自然科學(xué)基金的支持，進(jìn)展順利。該項(xiàng)目是張鵬博士倡導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎癥“老藥新用”策略的具體實(shí)施之一。

研究小組基于傳統(tǒng)中藥在RA治療中的特殊療效，從祖國醫(yī)學(xué)理論出發(fā)，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)的開發(fā)，從具有“舒筋活絡(luò)，祛風(fēng)除濕”的中藥品種中提取若干有效成分，用于對(duì)RA療效的觀察。從臨床前研究的角度，采用體外細(xì)胞及動(dòng)物模型為研究對(duì)象，進(jìn)行了前期實(shí)驗(yàn)。目前已經(jīng)篩選到了若干有效的中藥活性成分，推進(jìn)下一步的機(jī)理研究，最終期望將有活性的成分開發(fā)成RA治療中的療效確切的藥用品種。

本項(xiàng)目應(yīng)用研發(fā)團(tuán)隊(duì)核心成員楊家安博士具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的“蛋白質(zhì)折疊碼”技術(shù)，可將復(fù)雜的蛋白空間三位信息轉(zhuǎn)成具有一維結(jié)構(gòu)的編碼，并對(duì)藥物結(jié)合靶點(diǎn)特性以及藥物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行掃描比對(duì)，具有高效準(zhǔn)確的特點(diǎn)。張鵬博士主導(dǎo)聯(lián)合楊家安博士等核心人員建立了一整套“基礎(chǔ)研究靶點(diǎn)—蛋白質(zhì)折疊碼技術(shù)掃描分析—臨床用藥數(shù)據(jù)庫比對(duì)篩選—生物學(xué)有效性驗(yàn)證”的“老藥新用”研發(fā)策略體系。

據(jù)張鵬介紹，該研究策略在目前原創(chuàng)性化學(xué)新藥研發(fā)遇到巨大挑戰(zhàn)的大背景下，可為新藥研發(fā)提供重要借鑒?！袄纤幮掠谩钡牟呗钥蔀樾滤帲?.6類新藥）的研發(fā)提供捷徑。由于“老藥”已經(jīng)在臨床中廣泛應(yīng)用，在安全性上具有保障，可避免藥物上市后因不良反應(yīng)而“退市”的情況，同時(shí)可大大降低藥物研發(fā)成本及臨床用藥價(jià)格，進(jìn)而惠及大眾。

除此之外，張鵬研究團(tuán)隊(duì)對(duì)于膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型（CIA 模型）的創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)完善了對(duì)該疾病模型的認(rèn)識(shí)。在此項(xiàng)研究中，張鵬發(fā)現(xiàn)了先前文獻(xiàn)中未作報(bào)道的CIA模型發(fā)病足爪關(guān)節(jié)破壞規(guī)律以及特殊的組織病理學(xué)表現(xiàn)，為全面了解CIA模型發(fā)病的特點(diǎn)和規(guī)律提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過放射學(xué)和組織學(xué)觀察，進(jìn)一步完善了對(duì)其發(fā)病特點(diǎn)的描述，明確了該模型距下關(guān)節(jié)以及距舟關(guān)節(jié)為最早受累足爪關(guān)節(jié)的發(fā)病特點(diǎn)，在組織學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)了相鄰關(guān)節(jié)軟骨的“融合”現(xiàn)象，并在“融合”部位發(fā)現(xiàn)了新生血管的侵入以及新骨的生成，進(jìn)而提出了“炎癥影響關(guān)節(jié)軟骨的終末分化狀態(tài)進(jìn)而啟動(dòng)軟骨內(nèi)骨化”的科學(xué)假設(shè)，為研究RA發(fā)病中關(guān)節(jié)軟骨在骨贅生成中的作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)支持。相關(guān)成果發(fā)表在風(fēng)濕病領(lǐng)域國際SCI期刊《Rheumatology International》 上。

致力轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)，打造人才梯隊(duì)

篇6

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；OsVDAC5；可溶性表達(dá)；親和層析

中圖分類號(hào)：S511；Q816 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）11-2921-05

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.054

電壓依賴性陰離子通道蛋白（Voltage-dependent anion channels，VDAC）是線粒體外膜上具有高度保守性的孔狀蛋白，由一種小的多基因家族編碼，廣泛存在于真核生物中[1]，并在能量代謝、細(xì)胞凋亡、物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著決定性作用[2-4]。VDACs最早從草履蟲（Paramecium aurelia）線粒體外膜上分離得到[5]。哺乳動(dòng)物中主要有3種VDAC亞型[6]，真菌中主要有2種亞型[6]，而在植物中，煙草中至少有3種VDAC亞型，大豆、蒺藜苜蓿、百脈根和擬南芥中至少有5種不同的亞型[7-10]，水稻中存在8個(gè)VDAC基因[11]。與哺乳動(dòng)物和真菌相比，植物中有更多的VDAC異型體，表明植物VDAC具有多種不同的功能，但它們都有著相同的離子選擇性和電壓依賴性特性，并且具有相似的電生理學(xué)特征，說明VDAC在結(jié)構(gòu)和功能上具有一定的保守性[12]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)植物VDAC在植物的生長和發(fā)育階段以及在生物和非生物脅迫響應(yīng)方面都發(fā)揮著重要作用[10，13，14]。擬南芥中AtVDAC3能同葉綠體蛋白AtTrx m2相互作用，參與ROS信號(hào)通路，以應(yīng)答鹽脅迫[15]；AtVDAC1能同CBL1相互作用，在種子萌發(fā)與植物發(fā)育過程中負(fù)調(diào)控植物對(duì)外界溫度的應(yīng)答[13]。超表達(dá)OsVDAC3顯著提高了水稻的抗鹽性和抗旱性[16]。前期研究表明，OsVDAC5基因在YTA水稻生殖生長期達(dá)到最高表達(dá)水平[17]，表明OsVDAC5基因可能在水稻YTA的生殖發(fā)育期發(fā)揮重要功能。

在體外以大腸桿菌為宿主菌高效表達(dá)外源基因時(shí)，表達(dá)蛋白常常在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成包涵體。以包涵體形式存在的蛋白質(zhì)分子無定形，呈非水溶性，無生物活性，為后續(xù)研究帶來諸多不便[18]。VDAC蛋白為線粒體外膜蛋白，在原核表達(dá)時(shí)由于無法形成正確的次級(jí)鍵，大多以包涵體形式存在。雖然可以通過包涵體蛋白變性、復(fù)性等方法獲得可溶性蛋白，但蛋白質(zhì)的復(fù)性效率低，得到的可溶性蛋白常常會(huì)在結(jié)構(gòu)上發(fā)生改變，不利于后期進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)的功能[19]。研究表明，全長的OsVDAC5基因在體外表達(dá)時(shí)以包涵體形式存在[20]，因此，本研究擬通過生物信息學(xué)分析，將OsVDAC5基因截短為可溶性肽段，構(gòu)建pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）基因片段的原核表達(dá)載體進(jìn)行體外表達(dá)，以獲得可溶性目的蛋白，為OsVDAC5互作蛋白的研究及其在水稻生長發(fā)育過程中的生物學(xué)功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 原核表達(dá)載體pGEX-4T-1、大腸桿菌菌株DH5α、BL21（DE3）以及pET-32a-OsVDAC5質(zhì)粒均由中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 限制性內(nèi)切酶Quick CutTM BamH Ⅰ、Quick CutTM Xho Ⅰ，T4-DNA連接酶，Ex Taq酶，DL15 000和DL2 000 DNA Marker，GST Fusion Protein Purification Kit均購自Takara公司。DNA凝膠回收和清潔試劑盒均購自Axygen公司。Page RulerTM Prestained Protein Ladder購自Thermo公司。GST Tag Mouse Monoclonal Antibody及二抗羊抗鼠購自Abbkine公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物購自武漢博士德生物工程有限公司。引物合成及測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 C1000 Touch Thermal Cycler 型PCR儀和凝膠成像分析儀，購自美國Bio-RAD公司；Model 1 000分子雜交箱，購自美國Robbins Scientific Corporation；752N型紫外可見分光光度計(jì)，購自上海精科公司；Centrifuge 5415D、5417R和5810R離心機(jī)，購自德國Eppendoff公司；CR22G型高速離心機(jī)，購自日本Hitachi公司；Soniprep 150型超聲破碎儀，購自日本SANYO公司；半干式碳板轉(zhuǎn)移電泳槽、DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和膠片觀察燈，購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 OsVDAC5跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用生物信息學(xué)分析方法和不同在線生物學(xué)軟件（PRED-TMBB：http：//bioinformatics.biol.uoa.gr/PRED-TMBB/；BOCTOPUS： http：//boctopus.cbr.su.se/）對(duì)OsVDAC5蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜情況進(jìn)行初步預(yù)測和分析。

1.2.2 pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)OsVDAC5基因序列，以BamHⅠ和XhoⅠ作為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以pET-32a-OsVDAC5質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增目的片段。引物為Fw（5′CGCGGATCCATGAGCAAAGGCCCAGC3′）、Rv（5′CC GCTCGAGAGATTCACTATCAATCTTGACATCA3′）。采用20 μL體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，各反應(yīng)物濃度：15.3 μL ddH2O，2 μL 10×Ex Taq Buffer，1 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.3 μL Fw（10 mmol/L），0.3 μL Rv（10 mmol/L），1 μL稀釋100倍的pET-32a-OsVDAC5質(zhì)粒，0.1 μL Ex Taq酶。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，重復(fù)34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后使用AxyPrep DNA清潔試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行清潔回收，詳細(xì)操作參考試劑盒說明書，并進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ同時(shí)雙酶切目的片段和pGEX-4T-1空載體，37 ℃酶切3～4 h，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。用T4連接酶連接雙酶切后的目的基因和pGEX-4T-1載體，16 ℃連接過夜并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，將對(duì)應(yīng)陽性克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序分析。

1.2.3 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

1）融合蛋白的誘導(dǎo)。將pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）重組質(zhì)粒和pGEX-4T-1空載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3）表達(dá)菌株，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。分別挑取單克隆于3 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，第二天按1∶100的比例（V/V）接種于5 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6左右，加入1 mol/L IPTG至終濃度為0.7 mmol/L，分別于10、15、25、37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分別在誘導(dǎo)4、6、8 h時(shí)取樣5 mL，檢測誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)可溶性蛋白表達(dá)的影響。同時(shí)，誘導(dǎo)不加IPTG的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）和加IPTG的pGEX-4T1空載體的BL21菌株作為陰性對(duì)照。

2）融合蛋白的SDS-PAGE檢測。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，向菌體中加入1 mL預(yù)冷的1×PBS（pH 7.4）緩沖液，緩慢用槍頭吹打菌體使菌體重懸，冰水混合物中進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，每管破碎10 s，間隔10 s，共破碎2～3 min，收集空載體混合液。其余蛋白混合液于4 ℃，12 000 r/min離心15 min，分別收集蛋白上清液。向蛋白沉淀中加入1 mL蛋白沉淀變性液（10 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，pH 8.0）室溫放置1 h，期間混勻2～3次，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，即為沉淀液。取出各樣品200 μL，加入適量的5×SDS PAGE Loading buffer混合均勻，100 ℃煮沸10 min，80 V恒壓進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測。考馬斯亮藍(lán)染色液染色3 h后換脫色液，進(jìn)行脫色觀察。

3）融合蛋白的Western Blot檢測。對(duì)15、25、37 ℃條件下誘導(dǎo)8 h的蛋白上清液和沉淀液點(diǎn)樣進(jìn)行Western Blot檢測。半干式轉(zhuǎn)膜儀80 mA恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h后，加入40 mL蛋白封閉液室溫封閉1 h，按1∶5 000的比例（V/V）向封閉液中加入GST抗體， 4 ℃振蕩過夜，第二天按1∶10 000的比例（V/V）向封閉液中加入二抗羊抗鼠，孵育箱內(nèi)25 ℃振蕩孵育1.5 h后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測。

1.2.4 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白的純化 采用金斯瑞GST Fusion Protein Purification Kit對(duì)蛋白進(jìn)行親和層析。向?qū)游鲋屑尤? mL Glutathione Resin懸浮液，用10 mL預(yù)冷的1×PBS（pH 7.4）緩沖液平衡層析柱，將3 mL破碎后蛋白上清液加入層析柱，4 ℃緩慢振蕩孵育過夜。第二天收集流出液，加入32 mL預(yù)冷1×PBS（pH 7.4）緩沖液洗脫未和谷胱甘肽結(jié)合的蛋白，每次加入4 mL，孵育3 min，收集最后一次洗脫液。最后加入7 mL 10 mmol/L還原型GSH洗脫柱子上的蛋白，每次加入1 mL，孵育5 min，收集洗脫液。取出各樣品100 μL，加入適量的5×SDS PAGE Loading buffer混合均勻，100 ℃煮沸10 min，80 V恒壓進(jìn)行12%SDS-PAGE檢測?？捡R斯亮藍(lán)染色液染色3 h后換脫色液，進(jìn)行脫色觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsVDAC5跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

前期構(gòu)建了全長OsVDAC5基因原核表達(dá)載體，但是表達(dá)的蛋白以包涵體的形式存在，因此本研究利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測了OsVDAC5的跨膜方式，將PRED-TMBB和BOCTOPUS這兩個(gè)專門預(yù)測蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中β折疊結(jié)構(gòu)的生物學(xué)軟件的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行對(duì)比（圖1）。預(yù)測結(jié)果表明，OsVDAC5在線粒體外膜上可能分別以十二次跨膜（PRED-TMBB）或十八次跨膜（BOCTOPUS）的結(jié)構(gòu)存在，而且OsVDAC5蛋白的N端和C端有可能均位于線粒體雙層膜之間的膜間隙內(nèi)。因此，僅保留OsVDAC5蛋白75個(gè)氨基酸殘基，構(gòu)建只含N端75個(gè)氨基酸的pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達(dá)載體。

2.2 pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增鑒定pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）重組質(zhì)粒，檢測到目的基因的大小為250 bp。利用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，檢測到大小為5 000、250 bp的兩個(gè)條帶，與預(yù)期的條帶大小相同。將構(gòu)建好的載體測序，測序結(jié)果100%匹配，表明pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖2）。

2.3 SDS-PAGE檢測GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將陽性重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌株，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，用12%SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色，可觀察到在10、15、25、37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)條件下，4、6、8 h時(shí)在35 kDa的上清液和沉淀中均有蛋白表達(dá)，其大小與預(yù)測的GST-OsVDAC5（1-75aa）的蛋白產(chǎn)物大小相同，且不同溫度在8 h時(shí)蛋白的表達(dá)量較4、6 h高，15 ℃時(shí)上清液中的表達(dá)量較沉淀高。結(jié)果表明，OsVDAC5（1-75aa）基因在pGEX-4T-1系統(tǒng)中得到了高效表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物為部分可溶性蛋白（圖3）。

2.4 Western blot檢測GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

用GST單抗對(duì)10、15、25、37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)條件下誘導(dǎo)8 h的蛋白進(jìn)行Western blot檢測，IPTG誘導(dǎo)后的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白在35 kDa左右處的上清液和沉淀中均出現(xiàn)單一的信號(hào)條帶，而未加IPTG誘導(dǎo)的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）和空載體蛋白樣品在35 kDa左右處未見表達(dá)（圖4）。此結(jié)果進(jìn)一步表明pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）載體構(gòu)建成功，且GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白可在上清液中高效表達(dá)。

2.5 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白的純化

GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價(jià)親和，利用谷胱甘肽與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）之間酶和底物的特異性作用力，使得帶GST標(biāo)簽的GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白能夠與凝膠上的谷胱甘肽結(jié)合，從而將該蛋白與其他蛋白分離開。由于GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白在上清液中高效表達(dá)，因此通過10 mmol/L還原型GSH洗脫后進(jìn)行SDS-PAGE檢測，在35 kDa處可觀察到較為單一的蛋白條帶，得到純化的可溶性GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白（圖5）。

3 小結(jié)與討論

在植物中VDACs高度保守，但對(duì)不同VDAC的特定功能知之甚少。OsVDAC5互作蛋白的研究對(duì)揭示OsVDAC5蛋白的功能有重要意義。同時(shí)，進(jìn)行體外Pull-down試驗(yàn)時(shí)通常需要可溶性的VDAC蛋白。因此，獲得外源表達(dá)的可溶性蛋白至關(guān)重要。

試驗(yàn)室前期構(gòu)建了帶有His標(biāo)簽的pET-32a-OsVDAC5和pET-302a-OsVDAC5原核表達(dá)載體以及帶有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-1-OsVDAC5原核表達(dá)載體，但是體外表達(dá)的OsVDAC5融合蛋白幾乎都以包涵體的形式存在，暫時(shí)無法純化出可溶性的目的蛋白[20]，即全長的OsVDAC5基因在體外可能較難表達(dá)可溶性蛋白。因此，通過生物信息學(xué)的方法分析OsVDAC5的二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)域，將OsVDAC5基因截短為只含N端的75個(gè)氨基酸進(jìn)行體外表達(dá)。通過優(yōu)化表達(dá)條件，結(jié)果獲得了純度較為理想的可溶性GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白，也為OsVDAC5互作蛋白的研究和其在水稻中相關(guān)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] YOUNG M J，BAY D C，HAUSNER G，et al. The evolutionary history of mitochondrial porins[J]. BMC Evolutionary Biology，2007，7（1）：1-21.

[2] RAGHAVAN A，SHEIKO T，GRAHAM B H. Voltage-dependant anion channels：Novel insights into isoform function through genetic models[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA） Biomembranes，2012，1818（6）：1477-1485.

[3] ZHANG X S， BIAN X W， KONG J M. The proapoptotic protein BNIP3 interacts with VDAC to induce mitochondrial release of endonuclease G[J].PLoS ONE，2014，9（12）：e113642.

[4] MONACO G， DECROCK E， ARBEL N. The BH4 domain of anti-apoptotic Bcl-XL， but not that of the related Bcl-2， limits the voltage-dependent anion channel 1 （VDAC1）-mediated transfer of pro-apoptotic Ca2+ signals to mitochondria[J].Journal of Biological Chemistry，2015，290（14）：9150-9161.

[5] SCHEIN S J，COLOMBINI M，F(xiàn)INKELSTEIN A. Reconstitution in planar lipid bilayers of a voltage-dependent anion-selective channel obtained from paramecium mitochondria[J].The Journal of Membrane Biology，1976，30（1）：99-120.

[6] DE P V，GUARINO F，GUARNERA A，et al. Characterization of human VDAC isoforms：A peculiar function for VDAC3？[J].Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Bioenergetics，2010，1797（6-7）：1268-1275.

[7] TATEDA C，YAMASHITA K，TAKAHASHI F，et al. Plant voltage-dependent anion channels are involved in host defense against Pseudomonas cichorii and in Bax-induced cell death[J]. Plant Cell Rep，2009，28（1）：41-51.

[8] WANDREY M，TREVASKIS B， BREWIN N，et al. Molecular and cell biology of a family of voltage-dependentan ion channel porins in Lotus japonicus[J]. Plant Physiol，2004，134（1）：182-193.

[9] CLAUSEN C，ILKAVETS I，THOMSON R，et al. Intracellular localization of VDAC proteins in plants[J].Planta，2004，220： 30-37.

[10] TATEDA C，WATANABE K，KUSANO T，et al. Molecular and genetic characterization of the gene family encoding the voltage-dependent anion channel in Arabidopsis[J]. J Exp Bot， 2011，62：4773-4785.

[11] 夏春皎.水稻線粒體滲透性轉(zhuǎn)換的鑒定及其相關(guān)基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析[D].武漢：中南民族大學(xué)，2010.

[12] COLOMBINI M，MANNELLA C A.VDAC，the early days[J]. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Biomembranes，2012， 1818（6）：1438-1443.

[13] LI Z Y，XU Z S，HE G Y，et al. The voltage-dependent anion channel 1（AtVDAC1） negatively regulates plant cold responses during germination and seedling development in Arabidopsis and interacts with calcium sensor CBL1[J]. Inter J Mol Sci，2013，14（1）：701-713.

[14] DESAI M K，MISHRA R N，VERMA D，et al. Structural and functional analysis of a salt stress inducible gene encoding voltage dependent anion channel（VDAC） from pearl millet （Pennisetum glaucum）[J].Plant Physiol Biochem，2006，44（7-9）：483-493.

[15] ZHANG M，TAKANO T，LIU S，et al. Arabidopsis mitochondrial voltage-dependent anion channel 3（AtVDAC3） protein interacts with thioredoxin m2[J]. FEBS Lett，2015，589（11）： 1207-1213.

[16] 胡 穎，王春臺(tái)，覃永華.水稻基因OsVDAC3的逆境功能分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，34（6）：1-6.

[17] 羅鳳燕.水稻vdac、ant及HL-spl基因的表達(dá)研究[D].武漢：中南民族大學(xué)，2010.

[18] 付明娟，林接玉，謝捷明，等.包涵體蛋白復(fù)性的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2015（20）：3657-3659.

篇7

關(guān)鍵詞：高性能計(jì)算；應(yīng)用；中醫(yī)藥

中圖分類號(hào)：R-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5707（2016）06-0010-03

Abstract： High performance computing （HPC）， as a new and important research tool， has been applied in many fields successfully. Application of HPC in the TCM field is still in the exploratory stage. HPC in the future may be innovatively applied in the field of genomics Chinese herbal medicine， virtual medicine screening of new TCM， TCM data mining and big data analytics， modeling and simulation and so on.

Key words： high performance computing （HPC）； application； TCM

高性能計(jì)算是計(jì)算機(jī)科學(xué)的一個(gè)分支，研究并行算法和開發(fā)相關(guān)軟件，致力于開發(fā)高性能計(jì)算機(jī)。高性能計(jì)算是世界各國競相發(fā)展的前沿技術(shù)，是體現(xiàn)一個(gè)國家綜合實(shí)力和科技競爭力的重要指標(biāo)。

科學(xué)計(jì)算作為科研方法變革的產(chǎn)物，已經(jīng)發(fā)展成為與傳統(tǒng)的理論、實(shí)驗(yàn)并駕齊驅(qū)的第三種科研方法，并且日益成為越來越重要的科研方法?？茖W(xué)計(jì)算方法的運(yùn)用，是高性能計(jì)算應(yīng)用的基礎(chǔ)和前提條件，而使高性能計(jì)算真正發(fā)揮作用主要取決于高性能計(jì)算的應(yīng)用研究水平[1]。本文對(duì)于促進(jìn)高性能計(jì)算未來在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用、豐富中醫(yī)藥信息學(xué)的研究內(nèi)容及由此產(chǎn)生的中醫(yī)藥科研方法的創(chuàng)新具有推動(dòng)作用。

1 高性能計(jì)算應(yīng)用概況

1.1 我國在高性能計(jì)算應(yīng)用領(lǐng)域仍處于落后水平

在高性能計(jì)算的研發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域美國一直處于世界領(lǐng)先水平，日本和歐洲國家緊隨其后長期位居世界先進(jìn)行列。近年來，我國在高性能計(jì)算硬件的研發(fā)方面取得了突破性進(jìn)展，通過自主創(chuàng)新逐步掌握了一批硬件研發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)。中國國防科技大學(xué)研制的天河系列超級(jí)計(jì)算機(jī)連續(xù)多次在世界超級(jí)計(jì)算機(jī)排行榜中名列首位，標(biāo)志著我國高性能計(jì)算的硬件研究水平目前已經(jīng)接近國際先進(jìn)水平。但在應(yīng)用軟件方面的發(fā)展嚴(yán)重滯后于硬件的發(fā)展水平，自主開發(fā)的高性能計(jì)算應(yīng)用軟件嚴(yán)重匱乏，需要大量購買和引進(jìn)國外開發(fā)的應(yīng)用軟件，重要和關(guān)鍵部門的應(yīng)用受制于人[2]。應(yīng)用軟件是高性能計(jì)算應(yīng)用的基礎(chǔ)，由于應(yīng)用軟件研發(fā)水平的嚴(yán)重落后，目前我國在高性能計(jì)算應(yīng)用領(lǐng)域仍處于落后水平。

1.2 國內(nèi)外高性能計(jì)算主要的應(yīng)用領(lǐng)域

高性能計(jì)算作為嶄新和重要的科研工具，目前已經(jīng)在眾多的領(lǐng)域得到了成功應(yīng)用，各種前沿科學(xué)研究、技術(shù)開發(fā)和工程設(shè)計(jì)都越來越多地使用了高性能計(jì)算，高性能計(jì)算已經(jīng)日益成為科技創(chuàng)新的重要力量。目前主要的應(yīng)用領(lǐng)域包括氣象數(shù)值模擬與預(yù)報(bào)、地震預(yù)報(bào)、納米技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、空間科學(xué)、材料科學(xué)、計(jì)算物理、計(jì)算化學(xué)、流體力學(xué)、地震三維成像、石油勘探、天體星系模擬、大氣與海洋模擬、固體地球模擬、工業(yè)設(shè)計(jì)、核武器研究、全球氣候模型、湍流分析、飛行動(dòng)力學(xué)、海洋環(huán)流、流體力學(xué)和超導(dǎo)模型等[1]。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用目前主要集中在人類基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物設(shè)計(jì)、分子動(dòng)力學(xué)模擬等方面。

1.3 高性能計(jì)算應(yīng)用的瓶頸

高性能計(jì)算雖然已經(jīng)在眾多領(lǐng)域得到了成功應(yīng)用，但由于技術(shù)難度等的限制，仍然屬于高投入高產(chǎn)出的非普及型應(yīng)用。目前制約高性能計(jì)算應(yīng)用的主要問題包括軟件開發(fā)的技術(shù)難度非常大，系統(tǒng)使用成本過高，不僅體現(xiàn)在軟硬件購置費(fèi)用昂貴，而且系統(tǒng)運(yùn)行維護(hù)成本過高，大型系統(tǒng)的年電費(fèi)需上千萬元[2]。比較高精尖的應(yīng)用范圍、非常高的技術(shù)要求和過高的使用成本，這些都限制了高性能計(jì)算的廣泛應(yīng)用。

2 高性能計(jì)算在中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的可行性分析

2.1 高性能計(jì)算在領(lǐng)域應(yīng)用的前提條件

高性能計(jì)算在領(lǐng)域應(yīng)用的條件首先需要應(yīng)用領(lǐng)域具有較高的科研水平，特別是能夠通過科學(xué)計(jì)算的方法建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)物理模型和應(yīng)用軟件來解決實(shí)際問題，利用高性能計(jì)算才有可能促成應(yīng)用領(lǐng)域研究水平的大幅度提高。通過對(duì)高性能計(jì)算應(yīng)用領(lǐng)域的最高學(xué)術(shù)獎(jiǎng)戈登獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)項(xiàng)目的分析，這些獲獎(jiǎng)的應(yīng)用項(xiàng)目絕大多數(shù)都具有多學(xué)科交叉融合的背景，這反映了高性能計(jì)算的應(yīng)用需要應(yīng)用領(lǐng)域與計(jì)算機(jī)科學(xué)、數(shù)學(xué)等學(xué)科的跨學(xué)科合作[3]。隨著高性能計(jì)算的應(yīng)用，近些年高性能計(jì)算與應(yīng)用學(xué)科的交叉學(xué)科不斷涌現(xiàn)，產(chǎn)生了計(jì)算化學(xué)、計(jì)算物理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)等許多新興學(xué)科，這些交叉學(xué)科的產(chǎn)生標(biāo)志著高性能計(jì)算在這些領(lǐng)域得到了高水平應(yīng)用。

2.2 計(jì)算生物學(xué)的啟示

計(jì)算生物學(xué)是一門以生命科學(xué)中的現(xiàn)象和規(guī)律作為研究對(duì)象，以解決生物學(xué)問題為最終目標(biāo)，通過模擬和仿真的方法對(duì)生物學(xué)問題進(jìn)行定量和定性研究的新興學(xué)科。計(jì)算生物學(xué)與生物信息學(xué)比較，最大的不同之處在于生物信息學(xué)側(cè)重于生物信息的采集、存儲(chǔ)、處理和分析，而計(jì)算生物學(xué)側(cè)重于對(duì)生命現(xiàn)象進(jìn)行研究、解決生物學(xué)問題[4]。目前計(jì)算生物學(xué)領(lǐng)域的研究主要集中在蛋白質(zhì)行為的模擬、藥物分子的篩選、基因測序等方面。

雖然目前中醫(yī)藥領(lǐng)域還不滿足高性能計(jì)算的應(yīng)用條件，但通過借鑒計(jì)算生物學(xué)的研究方法，未來有可能在中醫(yī)藥領(lǐng)域開展具有創(chuàng)新性的高性能計(jì)算的應(yīng)用研究。

3 高性能計(jì)算在中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的展望

3.1 中藥植物藥的基因組學(xué)

基因組學(xué)是遺傳學(xué)的一個(gè)分支，研究生物基因組和如何利用基因，涉及基因作圖、測序和整個(gè)基因組功能分析，研究內(nèi)容包括以全基因組測序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)。基因組學(xué)是高性能計(jì)算應(yīng)用的一個(gè)重要方向，沒有高性能計(jì)算人類的基因組計(jì)劃就不可能實(shí)現(xiàn)，高性能計(jì)算已經(jīng)成為基因組學(xué)研究不可或缺的科研工具。隨著基因組學(xué)研究的深入、技術(shù)的成熟和成本的大幅度下降，使得基因組學(xué)的研究逐漸由人類的基因組學(xué)擴(kuò)展到動(dòng)物、植物等多個(gè)相近領(lǐng)域。利用高性能計(jì)算在基因組學(xué)方面成熟的應(yīng)用軟件開展中藥植物藥的基因組學(xué)研究未來有可能是高性能計(jì)算在中醫(yī)藥領(lǐng)域的重要應(yīng)用。

3.2 中藥新藥的虛擬藥物篩選

利用高性能計(jì)算進(jìn)行虛擬藥物篩選目前已經(jīng)成為西藥新藥開發(fā)的一條嶄新和重要的途徑。新藥研發(fā)的核心工作之一是從大量的化合物樣品庫中發(fā)現(xiàn)有藥理活性的化合物，計(jì)算機(jī)虛擬篩選輔助新藥開發(fā)是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)和分子模型化技術(shù)來指導(dǎo)新的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)或設(shè)計(jì)，從而減少實(shí)驗(yàn)室的工作量，縮短開發(fā)周期、降低開發(fā)成本。近年來對(duì)多靶點(diǎn)藥物的研究已經(jīng)成為國際上新藥開發(fā)的一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)，中藥是天然的多靶點(diǎn)藥物，蘊(yùn)含著巨大的新藥創(chuàng)制的潛力[5-6]。應(yīng)用高性能計(jì)算開展中藥新藥的虛擬藥物篩選有可能成為中藥新藥開發(fā)的嶄新途徑。

3.3 中醫(yī)藥數(shù)據(jù)挖掘和大數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)挖掘是從大量的、不完全的、有噪聲的、模糊的、隨機(jī)的實(shí)際應(yīng)用數(shù)據(jù)中，提取隱含在其中的、人們事先不知道的、但又是潛在有用的信息和知識(shí)的過程。大數(shù)據(jù)分析是指對(duì)規(guī)模巨大的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，目前世界各國對(duì)大數(shù)據(jù)分析技術(shù)高度重視，大數(shù)據(jù)被視為國家重要的戰(zhàn)略資源。數(shù)據(jù)挖掘和大數(shù)據(jù)分析是高性能計(jì)算應(yīng)用的重要領(lǐng)域之一。目前中醫(yī)藥領(lǐng)域的數(shù)據(jù)挖掘和大數(shù)據(jù)分析主要集中在對(duì)方劑配伍規(guī)律、中醫(yī)證治規(guī)律等的研究，現(xiàn)有的研究水平還不能構(gòu)成對(duì)高性能計(jì)算的迫切需求。隨著數(shù)據(jù)挖掘和大數(shù)據(jù)分析在中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用水平的提高，數(shù)據(jù)研究的內(nèi)容、方法和結(jié)果的日趨豐富，隨著數(shù)據(jù)量的積累和研究方法復(fù)雜度的提高，中醫(yī)藥數(shù)據(jù)挖掘和大數(shù)據(jù)分析未來有可能成為高性能計(jì)算在中醫(yī)藥領(lǐng)域富有潛力的應(yīng)用。

3.4 模擬與仿真

模擬與仿真是依靠計(jì)算機(jī)通過數(shù)值計(jì)算和圖像顯示的方法，對(duì)工程、物理、生物等各類問題進(jìn)行研究。高性能計(jì)算不僅具有強(qiáng)大的計(jì)算功能，還可以模擬或代替由于受經(jīng)濟(jì)或者其他條件限制不能進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。2013年10月，哈佛大學(xué)教授Martin Karplus、斯坦福大學(xué)教授Michael Levitt和南加州大學(xué)教授Arieh Warshel因“為復(fù)雜化學(xué)系統(tǒng)創(chuàng)立了多尺度模型”而獲得諾貝爾獎(jiǎng)，評(píng)委會(huì)聲明中稱這一成果意味著對(duì)于化學(xué)家來說計(jì)算機(jī)已經(jīng)成為同試管一樣重要的工具[1]。

計(jì)算機(jī)模擬方法在生命科學(xué)中已經(jīng)得到了迅速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。高性能計(jì)算應(yīng)用領(lǐng)域的最高學(xué)術(shù)獎(jiǎng)戈登獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)項(xiàng)目“在20萬CPU核和異構(gòu)體系結(jié)構(gòu)上的千萬億次持續(xù)性能血流模擬”，該項(xiàng)目模擬了血液流動(dòng)狀態(tài)，可以輔助血栓的早期病理學(xué)診斷及抗血栓藥物的研究。另一項(xiàng)獲獎(jiǎng)項(xiàng)目“呼之欲出的貓：包含109規(guī)模神經(jīng)元、1013規(guī)模突觸的大腦皮質(zhì)模擬”，對(duì)神經(jīng)元和突觸規(guī)模與貓大腦相當(dāng)?shù)拇竽X皮質(zhì)功能進(jìn)行了模擬，并以此為基礎(chǔ)開展了認(rèn)知計(jì)算的研究[3]。此外國內(nèi)外大量的高性能計(jì)算被用于分子動(dòng)力學(xué)模擬，分子動(dòng)力學(xué)模擬是一種數(shù)值模擬方法，通過將分子抽象為由化學(xué)鍵連接的質(zhì)點(diǎn)按照基于牛頓力學(xué)的數(shù)學(xué)模型迭代求解分子體系的行為。利用高性能計(jì)算進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬已經(jīng)成為化學(xué)和生物學(xué)研究中與實(shí)驗(yàn)手段相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)研究方式[7-8]。模擬和仿真技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用未來有可能成為高性能計(jì)算在中醫(yī)藥領(lǐng)域創(chuàng)新性的應(yīng)用。

4 小結(jié)

高性能計(jì)算的應(yīng)用是使高性能計(jì)算真正發(fā)揮作用的軟實(shí)力，是高性能計(jì)算領(lǐng)域重要的研究內(nèi)容。高性能計(jì)算的應(yīng)用需要多學(xué)科的交叉與合作，計(jì)算生物學(xué)的產(chǎn)生標(biāo)志著高性能計(jì)算在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了成功應(yīng)用。

高性能計(jì)算在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用目前還處于探索階段，尚不具備大規(guī)模應(yīng)用的條件和基礎(chǔ)。未來有可能通過借鑒計(jì)算生物學(xué)的研究方法在中藥植物藥的基因組學(xué)、中藥新藥的虛擬藥物篩選、中醫(yī)藥數(shù)據(jù)挖掘和大數(shù)據(jù)分析、模擬與仿真等領(lǐng)域進(jìn)行開創(chuàng)性的應(yīng)用研究。高性能計(jì)算在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用將會(huì)對(duì)中醫(yī)藥科研方法的創(chuàng)新與發(fā)展產(chǎn)生深刻的影響。

參考文獻(xiàn)

[1] 顧蓓蓓，武虹，遲學(xué)斌，等.國內(nèi)外高性能計(jì)算應(yīng)用發(fā)展概況分析[J].科研信息化技術(shù)與應(yīng)用，2014，5（4）：82-91.

[2] 周興銘.高性能計(jì)算技術(shù)發(fā)展[J].自然雜志，2011，33（5）：249-254.

[3] 張理論，鄧小剛.戈登獎(jiǎng)――分析與思考[J].計(jì)算機(jī)工程與科學(xué)， 2012，34（8）：44-52.

[4] 徐書華，金力.計(jì)算生物學(xué)[J].科學(xué)，2009，61（4）：34-37.

[5] 朱偉，羅頌平.治療輸卵管阻塞性不孕的中藥多靶活性成分計(jì)算機(jī)虛擬篩選[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23（6）：1531-1532.

[6] ，孫曉波.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化的新機(jī)遇[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（6）：696-703.

篇8

關(guān)鍵詞：統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)；在線開放課程；創(chuàng)新人才

隨著科技競爭的日趨激烈和人才國際化程度的不斷加快，我國拔尖人才日益緊缺。當(dāng)前高等教育工作的根本問題是人才培養(yǎng)質(zhì)量問題，其核心是學(xué)生創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。建立拔尖創(chuàng)新人才培養(yǎng)的有效機(jī)制，促進(jìn)創(chuàng)新人才脫穎而出，促進(jìn)高校探索創(chuàng)新型人才培養(yǎng)的新模式，促進(jìn)高校探索并建立以問題和課題為核心的教學(xué)模式，倡導(dǎo)以學(xué)生為主體的本科人才培養(yǎng)和研究型教學(xué)人才改革，調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性、主動(dòng)性和創(chuàng)造性，激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新思維和創(chuàng)新意識(shí)，是建設(shè)創(chuàng)新型國家，實(shí)現(xiàn)中華民族偉大復(fù)興的歷史要求，也是當(dāng)前對(duì)教育改革的迫切要求。

高等醫(yī)學(xué)院校主要是以專業(yè)為依托，全面提高學(xué)生綜合素質(zhì)。但是在限定學(xué)時(shí)的情況下，按部就班的講解已不能滿足學(xué)生對(duì)知識(shí)的需求，不能滿足創(chuàng)新人才培養(yǎng)的需要。由于統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)教學(xué)學(xué)時(shí)相對(duì)較少，教師要完成教學(xué)計(jì)劃，所以學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)只依靠課堂理論教學(xué)不會(huì)有顯著效果。學(xué)生可以利用課余時(shí)間在網(wǎng)絡(luò)上繼續(xù)拓展學(xué)習(xí)、深入學(xué)習(xí)、實(shí)踐學(xué)習(xí)。但是學(xué)生如何獲得優(yōu)質(zhì)的學(xué)習(xí)資源，如何對(duì)學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)起到促進(jìn)作用？這就需要一個(gè)學(xué)習(xí)、交流和實(shí)踐的平臺(tái)，統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程平臺(tái)建設(shè)就顯得尤為重要。

一、統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程建設(shè)的必要性和重要性

在線開放課程模式與傳統(tǒng)課堂教學(xué)模式相比，具有顯著的優(yōu)勢，學(xué)習(xí)不受時(shí)間段的限制。學(xué)習(xí)者可以合理安排進(jìn)行個(gè)性化的學(xué)習(xí)，反復(fù)觀看教學(xué)視頻，可以分析具體的問題，直到理解掌握為止。統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程建設(shè)將以服務(wù)平臺(tái)建設(shè)的形式，使學(xué)習(xí)者可以充分利用平臺(tái)資源，高效參與完整的教學(xué)過程。因此，統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程教學(xué)模式更方便學(xué)習(xí)者對(duì)知識(shí)點(diǎn)的學(xué)習(xí)，彌補(bǔ)課堂教學(xué)的不足。在線開放課程教學(xué)模式增強(qiáng)了教學(xué)吸引力，激發(fā)了學(xué)習(xí)者的學(xué)習(xí)積極性和自主性，擴(kuò)大了優(yōu)質(zhì)教育資源受益面，拓展了教學(xué)時(shí)空，有著傳統(tǒng)課堂教學(xué)模式無法比擬的優(yōu)勢，給高等醫(yī)學(xué)院校教學(xué)改革帶來了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，借助計(jì)算機(jī)的實(shí)現(xiàn)手段，研究生命體基因組遺傳和變異的一門應(yīng)用型課程。它是我校生物信息學(xué)專業(yè)重要的專業(yè)課，教學(xué)效果的好壞，直接影響到學(xué)生后續(xù)畢業(yè)設(shè)計(jì)的完成效果。其目標(biāo)是通過課程學(xué)習(xí)，培養(yǎng)學(xué)生利用統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)方法解決生物信息學(xué)相關(guān)問題，而這恰恰是一個(gè)從理論到實(shí)踐的過程。如果統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程得到建設(shè)并實(shí)踐應(yīng)用，它的相關(guān)理論和方法可以幫助遺傳學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)等專業(yè)解決實(shí)際問題，醫(yī)學(xué)院校其他專業(yè)的學(xué)生也可以利用網(wǎng)絡(luò)資源學(xué)習(xí)統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)知識(shí)，并成為其他專業(yè)學(xué)生了解生物信息的一個(gè)前導(dǎo)課程，提高統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)的應(yīng)用價(jià)值。因此，在線開放課程是培養(yǎng)學(xué)生生物信息學(xué)創(chuàng)新思維能力的重要途徑和手段，是高等醫(yī)學(xué)院校人才培養(yǎng)的需要和交流溝通的平臺(tái)。

二、統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程建設(shè)的主要平臺(tái)

結(jié)合高等醫(yī)學(xué)院校的特色，滿足高等醫(yī)學(xué)院校的統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)教學(xué)和學(xué)習(xí)者利用閑暇時(shí)間學(xué)習(xí)的需要，并以使統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程在實(shí)踐中得到應(yīng)用為目標(biāo)，以學(xué)生自主創(chuàng)新實(shí)踐為中心，建立與學(xué)生創(chuàng)新思維能力相適應(yīng)的統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)開放課程體系。擬解決理論與實(shí)踐相脫離、學(xué)生合作意識(shí)差、缺少學(xué)生自主構(gòu)建知識(shí)與能力的實(shí)踐活動(dòng)、缺少科學(xué)探究氛圍和缺乏對(duì)學(xué)生綜合能力的評(píng)價(jià)等問題。達(dá)到高等醫(yī)學(xué)院校對(duì)創(chuàng)新人才培養(yǎng)的目的。

（一）統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程的資源庫平臺(tái)建設(shè)

統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程的課程資源庫包括基礎(chǔ)教學(xué)資源和學(xué)術(shù)拓展資源?；A(chǔ)教學(xué)資源包括統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)的重要理論知識(shí)講解視頻、統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)常用軟件講解及介紹、統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)相關(guān)內(nèi)容（連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析、群體遺傳學(xué)等）的分析實(shí)例及數(shù)據(jù)等資源，給學(xué)生提供統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論的學(xué)習(xí)平臺(tái)，數(shù)據(jù)集庫是常用的分析數(shù)據(jù)集及數(shù)據(jù)庫鏈接，供學(xué)生練習(xí)和測試用。理論和實(shí)例相結(jié)合，提高學(xué)生分析問題和解決問題的能力；學(xué)術(shù)拓展資源包括統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域、用統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)可以解決的科學(xué)問題、統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)研究進(jìn)展及近期前沿?zé)狳c(diǎn)問題等資源，開拓學(xué)生視野。

（二）統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程的學(xué)生測試平臺(tái)建設(shè)

建設(shè)統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程的學(xué)生測試平臺(tái)，調(diào)用數(shù)據(jù)集庫中的數(shù)據(jù)，應(yīng)用學(xué)到的統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)知識(shí)解決實(shí)際問題，通過理論和實(shí)驗(yàn)的方式進(jìn)行測試，考核學(xué)生對(duì)基本理論知識(shí)的掌握程度，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題，彌補(bǔ)知識(shí)欠缺。使統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程在教學(xué)中得到很好的實(shí)踐應(yīng)用。

（三）統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程的實(shí)踐與創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)

建設(shè)統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程的實(shí)踐與創(chuàng)新平臺(tái)，定期留一些具體分析實(shí)例的題目，讓學(xué)生自由分組，開展自主探究活動(dòng)，各組自行設(shè)計(jì)方案，最后對(duì)應(yīng)的各個(gè)題目進(jìn)行分組匯報(bào)，激發(fā)學(xué)生的主動(dòng)探究精神，培養(yǎng)團(tuán)隊(duì)精神，提高學(xué)生的創(chuàng)新和實(shí)踐能力。

三、統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程建設(shè)具體思路及實(shí)施方案

（一）組建團(tuán)隊(duì)建設(shè)統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程資源庫

統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)教學(xué)團(tuán)隊(duì)由教學(xué)經(jīng)驗(yàn)豐富的5名教師組成，統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程建設(shè)資源庫的建設(shè)包括基礎(chǔ)教學(xué)資源和學(xué)術(shù)拓展資源，由基礎(chǔ)到實(shí)踐再到學(xué)術(shù)前沿應(yīng)用?；A(chǔ)教學(xué)資源包括教學(xué)章節(jié)理論內(nèi)容視頻、實(shí)驗(yàn)課常用軟件講解和常用分析的實(shí)例演示。按照教學(xué)大綱要求的重點(diǎn)和難點(diǎn)，團(tuán)隊(duì)中的教師根據(jù)各自擅長的章節(jié)內(nèi)容的知識(shí)點(diǎn)進(jìn)行視頻錄制，教學(xué)視頻要根據(jù)知識(shí)點(diǎn)難易程度去設(shè)計(jì)，每一個(gè)知識(shí)點(diǎn)錄制成一段微視頻，一個(gè)教學(xué)視頻一般不超過20分鐘；挑選典型性內(nèi)容做實(shí)例分析演示進(jìn)行視頻的錄制等。學(xué)術(shù)拓展資源是統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究成果，教師每周都查找國內(nèi)外文獻(xiàn)，搜集最新的科研成果放在統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程的學(xué)術(shù)拓展資源中，讓學(xué)生了解統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在生命科學(xué)中的應(yīng)用，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，體現(xiàn)該課程的重要性。

（二）組建統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程技術(shù)團(tuán)隊(duì)

為了取得更好的統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程設(shè)計(jì)效果，聘請專業(yè)人員給課題組人員進(jìn)行視頻錄制、頁面設(shè)計(jì)等方面的技術(shù)培訓(xùn)。讓統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程平臺(tái)更具特色、更吸引人眼球。同時(shí)對(duì)課程內(nèi)容及環(huán)節(jié)進(jìn)行整體設(shè)計(jì)，使其內(nèi)容豐富、精彩、精練，知識(shí)體系銜接緊密、結(jié)構(gòu)合理，提高課程吸引力和授課效果，給人一種耳目一新的感覺，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

（三）建立統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)在線開放課程的實(shí)踐與創(chuàng)新平臺(tái)

篇9

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)；植物抗性基因；基因組

生物學(xué)研究正進(jìn)入一個(gè)前所未有的新時(shí)期。大量數(shù)據(jù)、信息的獲得，使得生物學(xué)研究各領(lǐng)域均有很大轉(zhuǎn)變，其中包括植物抗性基因的研究。目前基因組研究已開始對(duì)植物生物學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，再過數(shù)年，人們將從當(dāng)前的描述性研究很快過渡到從已有的大量數(shù)據(jù)信息中提出假說，經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬分析，最后針對(duì)性地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證新的基因分析方法。實(shí)驗(yàn)將不再僅僅是分析基因――基因、蛋白質(zhì)――蛋白質(zhì)的相互作用，而是將獲取大量的RNAs，蛋白質(zhì)和相關(guān)代謝物等數(shù)據(jù)。

1 植物抗性基因研究現(xiàn)狀

1.1 植物自身抗性基因以等位基因系和基因簇形式存在

經(jīng)典遺傳學(xué)研究表明，在不同植物品系的同一基因位點(diǎn)上可能具有等位基因，這些等位基因?qū)Ω鞣N病原具有不同的特異性。此外，抗性基因往往在某一特定區(qū)域成簇存在。事實(shí)上，在特定的染色體區(qū)域常常不能分辨抗性基因位點(diǎn)上真正的等位基因和有關(guān)聯(lián)的成簇基因。利用具有不同抗性基因的植物進(jìn)行雜交可以澄清這一問題。

1.2 植物抗性基因的作用機(jī)制

Flor是第一個(gè)在植物和病原中同時(shí)研究抗性遺傳的植物病理學(xué)家，他研究亞麻和亞麻銹病病菌之間的相互作用。通過這些研究，他提出了基因?qū)蚣僬f。研究表明，植物和病原的遺傳組成和一株植物成功地進(jìn)行防御是密切相關(guān)的。植物―病原相互作用的專一性是由病原的一個(gè)顯性無毒基因產(chǎn)物和植物抗性基因產(chǎn)物間相互作用來決定的。因此，這兩個(gè)產(chǎn)物之間特異識(shí)別是植物抗性作用的基礎(chǔ)。這種識(shí)別觸發(fā)了進(jìn)一步的生理防御作用并導(dǎo)致超敏細(xì)胞死亡和對(duì)病原具有毒性的分子的積累。

1.3 植物抗性基因克隆

植物抗性基因的克隆目前主要采用轉(zhuǎn)座子標(biāo)記和定位克隆的方法，迄今為止，用這2種方法已克隆出22種抗性基因，其中用定位克隆方法得到16種，用轉(zhuǎn)座子標(biāo)記法得到6種。最近，有人又提出利用抗性基因類似序列（resistancegeneanalogs）通過PCR來特異擴(kuò)增抗性基因的方法。

1.4 轉(zhuǎn)基因改良植物脅迫耐性的困難及改進(jìn)措施

盡管轉(zhuǎn)基因改良植物脅迫耐性已取得一些進(jìn)展，目前仍存在以下困難：目的產(chǎn)物表達(dá)量不夠或時(shí)空表達(dá)不協(xié)調(diào)；目的產(chǎn)物翻譯后修飾（加工或折疊）不適當(dāng)，影響功能表達(dá)；目的酶所催化的代謝反應(yīng)前體物質(zhì)不足；細(xì)胞內(nèi)目的酶活性受制于pH、溫度及鹽離子濃度等因素；有些目的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用等。進(jìn)一步改進(jìn)措施有以下幾方面： ①選用來自近緣物種的目的基因；②構(gòu)建高效表達(dá)體系；③表達(dá)產(chǎn)物的胞內(nèi)區(qū)域化；④增加目的酶催化的前體物質(zhì)含量；⑤目的產(chǎn)物翻譯后修飾的調(diào)控；⑥抑制目的產(chǎn)物的副效應(yīng)。

2 植物抗性基因研究趨勢

基因的研究是指在許多基因同時(shí)存在的基礎(chǔ)上對(duì)多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行研究，分析各自與它們之間的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系。因而它至少涉及3個(gè)相關(guān)領(lǐng)域：結(jié)構(gòu)基因組――主要關(guān)心DNA堿基序列水平上的基因結(jié)構(gòu)；比較基因組――尋找種內(nèi)、種屬間產(chǎn)生基因結(jié)構(gòu)差異的分子基礎(chǔ)，以期獲取與目的性狀相關(guān)的基因；功能基因組――著重研究基因與其表達(dá)產(chǎn)物及功能活性的調(diào)控關(guān)系。結(jié)構(gòu)基因組是其它領(lǐng)域的基礎(chǔ)，比較基因組為功能基因組研究提供等位基因，蛋白質(zhì)組則是在蛋白質(zhì)水平上分析基因表達(dá)的功能基因組研究的派生分枝。生物信息學(xué)是在前面3者研究的基礎(chǔ)上，獲取、整理、綜合分析提取大量已有復(fù)雜生物數(shù)據(jù)的新學(xué)科，對(duì)相關(guān)學(xué)科的研究有很大的推動(dòng)作用。

基因組學(xué)（Genomics）的出現(xiàn)，使生物學(xué)研究進(jìn)入一個(gè)新的時(shí)期，即由僅對(duì)一個(gè)基因的研究轉(zhuǎn)向在基因組規(guī)模上同時(shí)對(duì)大量基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行系統(tǒng)的研究。無論從思想上還是技術(shù)方法上，基因組學(xué)已經(jīng)影響生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，植物的抗逆性研究也不例外。利用基因組學(xué)的方法，不但可以挖掘大量的抗性基因，對(duì)其功能進(jìn)行詳細(xì)的研究，而且有助于全面理解植物的抗逆機(jī)理，為利用遺傳工程提高植物抗性提供基礎(chǔ)。

以基因組為研究對(duì)象的基因組學(xué)是常規(guī)的以基因?yàn)閷?duì)象的分子生物學(xué)研究的一次飛躍。已有報(bào)道說明，基因組學(xué)方法在植物抗逆研究中的應(yīng)用處于起步階段，但隨著基因組學(xué)研究的發(fā)展，我們獲得大量與抗逆性有關(guān)的序列信息和生物功能信息，從而對(duì)植物抗逆復(fù)雜性會(huì)有更全面的理解。植物的抗逆性能往往不是由單基因決定的，而是由一系列相關(guān)的直接或間接作用的基因形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，任何一個(gè)環(huán)節(jié)都可能是至關(guān)重要的。因而對(duì)植物抗逆性的提高，尤其對(duì)一些屬數(shù)量性狀的抗逆性，僅靠轉(zhuǎn)移一個(gè)基因得到耐逆植物有一定的難度，轉(zhuǎn)入一系列基因也許是必需的，即利用基因組工程，而不只是基因工程來提高植物抗性?；蚪M學(xué)的研究為植物抗逆遺傳工程提供大量的全新基因，從而為抗逆育種提供了更廣闊的前景。

3 展望

我們正經(jīng)歷一個(gè)快速發(fā)展的階段，與幾年前相比，已有許多那時(shí)想都不敢想的工具與能力。目前已開始從單個(gè)抗性基因的鑒定克隆轉(zhuǎn)移到抗性基因表型的全面分析。可以預(yù)測，在不久的將來，不用通過實(shí)驗(yàn)鑒定，我們在計(jì)算機(jī)上通過序列比較和功能模擬分析，就能預(yù)測新克隆的抗性基因的功能。大規(guī)模的新方法、新技術(shù)的應(yīng)用，將為我們獲取新抗性基因并使之變成可操作利用提供機(jī)會(huì)。

參考文獻(xiàn)

1 閻隆飛，張玉麟.分子生物學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社， 1997

篇10

【摘要】 抗生素的大量使用和濫用所造成的細(xì)菌廣泛的耐藥性迫使科研人員要加速尋找結(jié)構(gòu)新穎的抗生素?？股刈饔冒悬c(diǎn)的發(fā)掘?qū)λ幬锇l(fā)現(xiàn)非常重要，本文綜述了近幾年來國際上運(yùn)用基因組學(xué)、基因芯片等現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)，利用細(xì)菌體內(nèi)的各種酶反應(yīng)與理化特性，發(fā)掘抗生素傳統(tǒng)作用新靶點(diǎn)如脂肪酸合成酶、非傳統(tǒng)作用新靶點(diǎn)如雙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)、群體感應(yīng)器等的研究進(jìn)展，這對(duì)新抗生素的發(fā)現(xiàn)具有一定的指導(dǎo)意義。

【關(guān)鍵詞】 抗生素； 新靶點(diǎn)； 耐藥性； 基因組學(xué)

ABSTRACT Widespread bacterial drug resistance originated from massive uses and abuses of antibiotics drives drug discovery in a remarkable speed path. At the same time， finding functional target of antibiotics was extremely important to the drug evaluation. Novel targets can be found through modern biological information technology such as gene chip technique and genomics， along with bacterial enzymatic reactions in vivo and the physiological characteristics. In this paper， we summarized some novel antibiotic targets from traditional bacterial functionality and nontraditional domains in these last few years， including fatty acid synthases， two-component signal transduction systems and quorum-sensing systems. These new research progresses on novel targets will be a positive strength in novel antibiotic discovery.

KEY WORDS Antibiotics; Novel target; Drug resistance; Genomics

1941年人類首次實(shí)現(xiàn)青霉素的工業(yè)生產(chǎn)，啟動(dòng)了抗生素應(yīng)用的歷史。隨后30多年的研究先后發(fā)現(xiàn)了β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和多肽類、多烯類等幾大類抗生素，并成功地應(yīng)用于治療各種病原微生物感染?？茖W(xué)界一度樂觀地認(rèn)為，持續(xù)不斷地發(fā)現(xiàn)新抗生素藥物將最終使人們徹底擺脫感染性疾病。然而，隨后的40年，盡管藥物研究的投入越來越大，卻很少有新碳骨架化合物作為臨床藥物得以開發(fā)。近些年來，由于過度使用抗生素，特別是濫用抗生素，病原菌日益廣泛的耐藥性已成為藥物治療中越來越常見的問題［1～3］，人們迫切需要尋找新的抗生素藥物。

為了克服細(xì)菌的耐藥性，特別是多重耐藥性問題，人們需要運(yùn)用新的思路去發(fā)掘新的抗生素。20世紀(jì)90年代以來，隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，人們獲得了豐富的基因信息與數(shù)據(jù)，闡明了上千個(gè)蛋白新靶點(diǎn)。一些影響細(xì)菌生長和致病的關(guān)鍵基因的發(fā)現(xiàn)以及以此為靶點(diǎn)的相應(yīng)篩選模型的構(gòu)建是發(fā)現(xiàn)抗耐藥細(xì)菌的新抗生素的關(guān)鍵。本文綜述了近年來科學(xué)家們發(fā)掘抗生素作用新靶點(diǎn)所采取的方法、主要靶點(diǎn)類型和有關(guān)作用機(jī)制。

1 運(yùn)用基因組學(xué)來開發(fā)抗生素新靶點(diǎn)

基因組學(xué)是為了闡明各種生物基因組中堿基對(duì)的序列信息，破譯相關(guān)的遺傳與功能而形成的一門基礎(chǔ)學(xué)科。目前，國際上已經(jīng)完成了人類、多種細(xì)菌等微生物、多種昆蟲、多種嚙齒類動(dòng)物的全基因組序列測定工作。從致病與非致病微生物的基因組序列與功能研究中發(fā)掘抗生素的新靶標(biāo)，是生物信息學(xué)、病原微生物學(xué)和藥物化學(xué)等多學(xué)科綜合、交叉的研究領(lǐng)域，有關(guān)研究不僅開辟了藥物研究的新領(lǐng)域，也將為微生物及其活性產(chǎn)物的利用開辟新的研究熱點(diǎn)。目前運(yùn)用基因組學(xué)開發(fā)抗生素新靶點(diǎn)的主要研究方法概括如下。

1.1 尋找細(xì)菌致病開放閱讀框

為成功研發(fā)新藥，人們不斷運(yùn)用各種手段來篩選抗菌藥物作用靶點(diǎn)［4］，一般首先考慮以下三個(gè)篩選標(biāo)準(zhǔn)：①運(yùn)用生物信息學(xué)尋找所有潛在藥物靶細(xì)菌體內(nèi)保守的開放閱讀框(ORFs)；②發(fā)現(xiàn)一些只在原核細(xì)胞中出現(xiàn)，而不在真核細(xì)胞特別是高等真核細(xì)胞中出現(xiàn)的ORFs；③運(yùn)用藥物靶細(xì)菌體內(nèi)功能基因敲除技術(shù)來驗(yàn)證這些ORFs是否決定了一個(gè)或多個(gè)病原菌的致病力。符合以上三個(gè)篩選標(biāo)準(zhǔn)的基因就是最佳的備選靶標(biāo)基因。

Rosamond等［5］通過30多個(gè)微生物基因組的生物信息學(xué)分析尋找到了多個(gè)藥物作用靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)影響微生物的生存與繁殖，在病原菌中高度保守，而在人體內(nèi)或者完全缺失，或者截然不同。他們將大腸埃希菌的4289個(gè)基因與七種呼吸道疾病致病菌(包括銅綠假單胞菌、流感嗜血菌和肺炎鏈球菌等)的基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所有這些細(xì)菌中都有246個(gè)基因高度保守，其中68個(gè)基因人類缺失；經(jīng)進(jìn)一步比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這68個(gè)基因中有34個(gè)功能未知，其中16個(gè)是非關(guān)鍵基因，另外18個(gè)則特別重要，包括喹諾酮和大環(huán)內(nèi)酯抗生素的作用靶點(diǎn)。他們選擇這18個(gè)基因中的3個(gè)作為靶點(diǎn)基因用于藥物篩選，尋找治療呼吸道疾病的新藥，取得了很好的結(jié)果［5］。

1.2 確定關(guān)鍵基因的功能

采用各種遺傳變異方法確定未知保守基因的功能，如熱敏變異、堿基標(biāo)記誘變、反義RNA系統(tǒng)表達(dá)以及功能基因敲除等方法［6］，以及鑒定蛋白質(zhì)性質(zhì)，確定其是否具有用于藥物篩選的潛力。

日本研究者從臨床分離到耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐萬古霉素金葡菌Mu50(VRSA)［7］，它們有70多個(gè)代表基因(總共2600個(gè)基因)與新的毒性因子有關(guān)，這些毒性因子能增強(qiáng)耐藥菌株對(duì)人的致病力，當(dāng)然也是更為廣泛的潛在抗生素靶點(diǎn)。

1.3 闡明關(guān)鍵基因產(chǎn)物的功能

有研究者采用高通量基因組結(jié)構(gòu)分析方法［8］闡明蛋白質(zhì)X衍射結(jié)構(gòu)，根據(jù)結(jié)構(gòu)將它們進(jìn)行分類，在一級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行折疊，考察二級(jí)結(jié)構(gòu)，并預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)與功能。也有人使用細(xì)菌基因芯片或基因表達(dá)圖譜［9］，評(píng)價(jià)不同條件下的mRNAs表達(dá)水平。通過不同濃度抗生素的作用，挑選出最敏感的基因。例如，在含有97%結(jié)核分枝桿菌基因的基因芯片上添加抗結(jié)核藥物，測試藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌基因表達(dá)的影響，了解關(guān)鍵基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能。

1.4 通過基因體內(nèi)表達(dá)確定靶標(biāo)基因

作為基因?qū)W方法的補(bǔ)充，確定關(guān)鍵基因后，一般還要通過實(shí)驗(yàn)來確定病原菌感染脊椎動(dòng)物的必需基因，因?yàn)橛袝r(shí)細(xì)菌在培養(yǎng)皿中生長的非必需基因可能是感染動(dòng)物和人的關(guān)鍵基因。基因如何在體內(nèi)表達(dá)和哪些基因是細(xì)菌致病所必需的，一般都要通過體內(nèi)表達(dá)來確定［10］，細(xì)菌的基因雖然很多，但在感染動(dòng)物時(shí)只打開特定基因來實(shí)現(xiàn)自我生存和繁殖，例如有的基因負(fù)責(zé)啟動(dòng)生物合成和指導(dǎo)鐵離子螯合劑的重新攝取，因?yàn)樗屑棺祫?dòng)物宿主的胞內(nèi)或胞外運(yùn)鐵蛋白上都螯合鐵離子。除此之外還需考察篩選得到的抗生素在臨床上是否真正有效，以及耐藥菌株出現(xiàn)的速率是否降低?？傊ㄟ^對(duì)細(xì)菌基因組的深入研究，可以發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)，使藥物更特異地作用于特定的位點(diǎn)。

2 對(duì)某些典型靶點(diǎn)的重新發(fā)掘

隨著基因組研究和對(duì)微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)與分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入，新靶點(diǎn)不斷涌現(xiàn)，為抗生素的研發(fā)提供了新的途徑，使我們可以深入研究復(fù)合靶標(biāo)的不同部位，以增強(qiáng)篩選的特異性，減少過篩量，提高篩選效率。在細(xì)胞壁生物合成、蛋白質(zhì)生物合成和DNA復(fù)制與修復(fù)過程的傳統(tǒng)藥物靶點(diǎn)中還是有希望找到一些新靶點(diǎn)，這引起了研究者們的高度興趣。

2.1 抑制細(xì)胞壁生物合成的新靶點(diǎn)

細(xì)菌細(xì)胞壁生物合成，尤其是肽聚糖(PG)的合成是第一類天然化合物篩選靶點(diǎn)，也是傳統(tǒng)抗菌藥物最早的靶點(diǎn)之一，對(duì)這類靶點(diǎn)的合成途徑和抗生素作用機(jī)制的研究比較透徹。那么，針對(duì)抑制細(xì)胞壁和細(xì)胞膜合成是否還存在新的靶點(diǎn)？這里展示幾個(gè)具有開發(fā)價(jià)值的研究實(shí)例。

(1)葡萄球菌糖肽酶 在葡萄球菌PG層的生物合成中，肽鏈之間不是通過Lys3和D-Ala4直接相連，而是通過五甘氨酸橋聯(lián)［11］。主要的表面抗原蛋白、S.pyogenes的蛋白M、咽炎與皮膚損傷的致病因子和金葡菌的蛋白A都是通過一段保守的C端四肽(LPXT)和五甘氨酸橋共價(jià)相連。由于五甘氨酸是在fem基因指導(dǎo)下加入的，所以fem基因可以成為輔助藥物靶點(diǎn)基因，阻斷糖肽酶的作用，有望成為降低鏈球菌感染致毒的好方法。生物信息學(xué)分析表明，革蘭陽性菌基因組中除了fem基因外，還有多個(gè)糖肽酶基因。糖肽酶結(jié)構(gòu)闡明后，加快了基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)技術(shù)的發(fā)展步伐［12］。

(2)糖基轉(zhuǎn)移酶 多年來人們一直認(rèn)為糖基轉(zhuǎn)移酶在二糖酰五肽單元聚合到PG鏈上起著關(guān)鍵作用，但由于缺乏實(shí)驗(yàn)底物，膜的性質(zhì)又不是很清楚，分離純化和結(jié)構(gòu)表征比較困難［13］，沒能對(duì)之進(jìn)行系統(tǒng)研究。基因序列分析表明，大腸埃希菌中有4種糖基轉(zhuǎn)移酶，而且在初級(jí)病原菌中數(shù)量眾多，有的是糖基轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)肽復(fù)合酶，有的則是單功能糖基轉(zhuǎn)移酶。

Ye等［14］采用酶聯(lián)化學(xué)法，利用I型脂的類似物和糖基轉(zhuǎn)移酶MurG作用，獲得多種脂-二糖酰-五肽II型脂的類似物，并進(jìn)行關(guān)于膜的糖基轉(zhuǎn)移酶實(shí)驗(yàn)。如果能夠合成出較大的碳水化合物庫［15］，就能找到抑制糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性配體化合物。半合成的N-芳酰衍生物(如N-氯二苯-萬古霉素和N-chlorebiphenyl-chloroeremomycin)對(duì)VRE菌的活性要比它們的糖肽類母體強(qiáng)80倍左右。由于這些N-芳酰糖肽類與N-酰基-D-Ala-D-Lac結(jié)合的強(qiáng)度沒有萬古霉素或Chloroeremomycin的牢固，有人認(rèn)為，N-芳酰糖肽類進(jìn)攻的是糖基轉(zhuǎn)移酶［16］。

2.2 抑制蛋白質(zhì)合成的新靶點(diǎn)

在第二類傳統(tǒng)抗菌藥物靶點(diǎn)即蛋白質(zhì)合成抑制藥物的靶點(diǎn)中，我們也有機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)新的抗生素靶點(diǎn)。這方面的研究以Belova等［17］和Huntington等［18］的工作比較突出，其中肽脫甲酰酶已經(jīng)成為用于新藥臨床實(shí)驗(yàn)的少數(shù)幾種抗菌靶點(diǎn)之一。

(1)核糖體作為抗生素的靶點(diǎn) 抗生素一般結(jié)合的是16S或23S rRNA分子中的關(guān)鍵位點(diǎn)。23S rRNA第五結(jié)構(gòu)域包含了從肽酰轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)到初生肽鏈［19］的轉(zhuǎn)運(yùn)出口肽酰轉(zhuǎn)移酶中心，還包含紅霉素(erythromycin)和泰洛星(tylosin)的結(jié)合位點(diǎn)［20］。第五結(jié)構(gòu)域還與其他抗生素如鏈陽菌素(streptogramin)和林肯酰氨克林霉素(lincosamide clindamycin)等的結(jié)合位點(diǎn)有部分重疊，所以在研究結(jié)構(gòu)時(shí)可能找到與RNA中一個(gè)或多個(gè)亞基結(jié)合的新抗生素。

天然產(chǎn)物晚霉素(eveninomycin)的靶位也是非典型核糖體結(jié)合位點(diǎn)［18］。晚霉素是一種兩端結(jié)合著酚酰羧基酯的糖，與23S rRNA的89號(hào)和91號(hào)螺環(huán)結(jié)合，阻止起始因子IF2蛋白與之結(jié)合，終止起始氨基酸fMet tRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)。

以硫鏈絲菌素(thiostrepton)、諾西肽(nosiheptide)和GE2270A為代表的天然抗生素硫蛋白族［21］通過阻斷一種核糖體伴侶蛋白而抑制蛋白質(zhì)生物合成。硫鏈絲菌素和諾西肽攻擊23S rRNA的A1087結(jié)構(gòu)域，同時(shí)阻斷延長因子EF-G在肽酰轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)與核糖體的結(jié)合。GE2270A通過攻擊GTP酶EF-Tu因子來阻斷核糖體的肽酰轉(zhuǎn)移反應(yīng)。從這個(gè)基礎(chǔ)上研究EF-Tu的結(jié)構(gòu)對(duì)抗生素的結(jié)構(gòu)與性能優(yōu)化是非常有意義的。

(2)肽脫甲酰酶與甲硫氨酸氨肽酶 細(xì)菌在起始因子IF2的作用下，以fMet tRNA作為起始氨酰tRNA開始蛋白質(zhì)的生物合成。甲硫氨酰的N-甲?；ＷCfMet在肽鏈形成時(shí)作為電子供體而非受體，加強(qiáng)了合成起始的方向性。當(dāng)延長肽鏈出現(xiàn)在核糖體上時(shí)，肽脫甲酰酶(deformylase)酶解掉其N-甲?；?8］，然后甲硫氨酸氨肽酶(methionine aminopeptidase)水解脫去甲硫氨酸的N端。通過大腸埃希菌的基因敲除分析，認(rèn)為肽脫甲酰酶和甲硫氨酸氨肽酶是蛋白質(zhì)合成所必需的，所以它們可以作為抗菌劑的有效靶標(biāo)。肽脫甲酰酶是一種金屬蛋白酶(metallopeptidase)，可被具有金屬螯合作用的配體［22］譬如天然的二肽酰-羥氨酸-放線酰胺素(dipeptidyl hydroxamate actinonin)中的羥氨酸所抑制。這些化合物常用作細(xì)菌抑制劑而非殺菌劑，雖然可以降低變種的適應(yīng)性，但變種出現(xiàn)的頻率仍然較快，所以尋找更廣譜長效的肽脫甲酰酶抑制劑將成為研究目標(biāo)。

(3)氨酰-tRNA合成酶 天然產(chǎn)物莫匹羅星(mupirocin)能通過抑制Ile-tRNA合成酶的作用使異亮氨酸不能參與蛋白質(zhì)合成。莫匹羅星與金葡菌的Il-tRNA合成酶的復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明［23］，證明它與活性位點(diǎn)配位，并與Ile-AMP相互競爭。對(duì)其他細(xì)菌和真核生物tRNA合成酶進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有的化合物對(duì)純化的tRNA合成酶具有一定活性，目前暫時(shí)還沒有發(fā)現(xiàn)具有臨床價(jià)值的類似物，但仍然不失為一個(gè)有潛力的靶標(biāo)。

2.3 DNA復(fù)制與修復(fù)的新靶點(diǎn)

DNA是生物的遺傳物質(zhì)，具有穩(wěn)定、多樣和自我復(fù)制的特點(diǎn)。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制保證了DNA在進(jìn)行準(zhǔn)確地復(fù)制時(shí)，將遺傳物質(zhì)正確地傳給下一代，同時(shí)保持核酸鏈的完整性。DNA實(shí)現(xiàn)其功能時(shí)需要一系列酶參與反應(yīng)，包括DNA回旋酶。DNA回旋酶是細(xì)菌特有的一種拓?fù)洚悩?gòu)酶，其抑制劑在臨床上的應(yīng)用也越來越廣。

(1)DNA回旋酶：新喹諾酮和非喹諾酮的作用靶點(diǎn) DNA回旋酶是喹諾酮抗菌劑的典型靶點(diǎn)，也是新喹諾酮分子的作用靶點(diǎn)。新喹諾酮分子層出不窮，包括群體獲得性肺炎中抗青霉素肺炎鏈球菌的抑制物左氧氟沙星(levofloxacin)等。曲伐沙星(trovafloxacin)在1998年獲批，但因?yàn)楦闻K毒性而限制臨床使用。8-甲氧基喹諾酮莫西沙星(moxifloxacin)和加替沙星(gatifloxacin)在1999年獲批，它們抗葡萄球菌活性大大增強(qiáng)，可以用于治療群體獲得性肺炎、支氣管炎和鼻竇炎［24］。各種含有橋頭N，具有2-吡喏酮環(huán)系統(tǒng)的喹諾酮對(duì)抗喹諾酮的變異回旋酶仍然具有抑制活性。據(jù)報(bào)道，克林沙星(clinafloxacin)和西他沙星(sitafloxacin)對(duì)回旋轉(zhuǎn)亞基GyrA和拓?fù)洚悩?gòu)酶第Ⅳ結(jié)構(gòu)域ParC的突變型均具有抑制活性［25］。

(2)RNA解旋酶 在RNA的代謝動(dòng)力過程中，RNA與DNA、RNA與RNA、RNA與蛋白質(zhì)之間能形成并且必須形成具有特異性和較高動(dòng)力學(xué)效率的過渡態(tài)復(fù)合物。一定長度或全長RNA經(jīng)過折疊、展開和重新折疊，才能實(shí)現(xiàn)其生物功能。能將RNA分子展開的酶稱為RNA解旋酶(helicase)［26］，它利用NTP水解釋放的能量來驅(qū)動(dòng)譬如雙鏈RNA的展開。RNA解旋酶有時(shí)作用于原核生物的基因轉(zhuǎn)錄、核糖體生物合成、翻譯起始和RNA降解等過程，有時(shí)也作用于真核生物的mRNA編輯、拼接和RNA向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。分析認(rèn)為，既然RNA解旋酶是細(xì)菌功能所必需的，那么它可以成為抑制物的作用靶標(biāo)。

3 其他非傳統(tǒng)的抗生素作用新靶點(diǎn)

前面提到某些新靶點(diǎn)是通過基因組學(xué)方法尋找，或從傳統(tǒng)靶點(diǎn)中發(fā)掘的，除此之外，細(xì)菌的酶系反應(yīng)和生理過程也可作為抗生素的靶點(diǎn)［27］。目前已發(fā)現(xiàn)幾百個(gè)新靶點(diǎn)，通過一系列高通量和自動(dòng)化的篩選實(shí)驗(yàn)以及對(duì)同簇基因產(chǎn)物的復(fù)雜性分析(如某些基因產(chǎn)物在動(dòng)物體內(nèi)是毒性因子，在培養(yǎng)基上卻不能產(chǎn)生)，可以確定其功能并用于藥物篩選。以下介紹幾個(gè)比較典型的非傳統(tǒng)靶點(diǎn)。

3.1 脂肪酸合成酶

脂肪酸的合成對(duì)細(xì)菌的生存與發(fā)育至關(guān)重要。研究結(jié)果表明，在I、II構(gòu)型亞基中的脂肪酸的合成與聚酮類天然產(chǎn)物的生物合成途徑非常相似。在真核細(xì)胞中的I型酶系中，脂肪酸合成酶(FASs)由多個(gè)亞基組成，而大多數(shù)細(xì)菌的II型酶系中FASs則為單個(gè)亞基，找到特異性抑制物是完全可能的。具有抑制FASs活性的天然產(chǎn)物淺藍(lán)菌素(cerulenin)，通過烷基化作用使FASs中的酮基合成酶經(jīng)過環(huán)氧化物的開環(huán)而造成親核性Cys活性位點(diǎn)失活。選擇性更高的抑制物對(duì)細(xì)菌酮基合成酶會(huì)更有效。

最近，有人發(fā)現(xiàn)三氯森(triclosan)類抗菌防腐劑可阻斷大腸埃希菌烯酰-ACP還原酶Fab I催化脂肪酸合成酶的烯鍵飽和作用，這說明FASs是較好的靶點(diǎn)。

3.2 異檸檬酸裂解酶

結(jié)核分枝桿菌的各種脂肪酸代謝過程都有可能成為新靶點(diǎn)，這是因?yàn)樘嫉霓D(zhuǎn)化方向是從脂肪酸經(jīng)過乙醛酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖。盡管乙醛酸分支酶［如異檸檬酸(isocitrate)裂解酶］對(duì)平板培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌的生存關(guān)系不大，但對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的毒性至關(guān)重要［28］，這表明病原菌在體內(nèi)感染時(shí)依靠脂肪酸作為能量來源。這是一個(gè)毒性篩選的例子，但同樣可以發(fā)展為潛在的新靶標(biāo)。以前沒有報(bào)道過異檸檬酸裂解酶的選擇性抑制物，可以對(duì)它進(jìn)行藥物篩選研究。

3.3 雙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)

細(xì)菌通常使用雙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction system)來感受體外瞬時(shí)化學(xué)變化(圖1)，其中兩個(gè)蛋白分別作為感受器(sensor)和響應(yīng)控制器(response regulator)［29］。感受器是一種典型的跨膜組氨酸激酶，響應(yīng)控制器是一種DNA轉(zhuǎn)錄激活子(activator)。感受器的細(xì)胞周質(zhì)環(huán)型蛋白和跨膜蛋白感受到配體后，引起感受器胞質(zhì)組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中組氨酸活性位點(diǎn)的自磷酸化，然后磷酸官能團(tuán)從P-His轉(zhuǎn)移到響應(yīng)控制器氨基酸亞基上的一段保守的Asp-β-羧基上。響應(yīng)控制器P-Asp的形成會(huì)引發(fā)DNA作用域的變構(gòu)效應(yīng)，然后激活子阻遏目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄(假如它的基態(tài)是阻遏物)并啟動(dòng)響應(yīng)程序。

VRE菌的VanS-VanR雙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是一個(gè)典型的感受/傳導(dǎo)系統(tǒng)，雙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌毒性起

圖1

雙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)示意圖(根據(jù)文獻(xiàn)［30］重繪)

決定作用。有人使用基因組學(xué)的方法來表征肺炎鏈球菌的雙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，并檢測到14個(gè)雙信號(hào)基因?qū)Γ?0］。如果金葡菌體內(nèi)雙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)srhS-srhR基因?qū)υ獾狡茐模瑢?dǎo)致大鼠腎盂腎炎(pyelonephritis)模型中金葡菌突變株的生長降低1000倍。mRNA序列分析表明雙信號(hào)基因?qū)﹃P(guān)系到病原菌的生長能力，特別是當(dāng)病原菌從氧濃度低的環(huán)境轉(zhuǎn)向厭氧代謝時(shí)。金葡菌兼性厭氧的特征，使得它能進(jìn)入深層組織進(jìn)行持續(xù)的感染。這些結(jié)果為分析8對(duì)雙信號(hào)感受/傳導(dǎo)基因在致病機(jī)制中的特殊作用提供了基礎(chǔ)，包括黏附和自融過程等等，并能幫助我們優(yōu)選出最佳的雙信號(hào)基因?qū)ψ鳛榭咕袠?biāo)。

3.4 群體感應(yīng)器的生物合成

細(xì)菌使用群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum-sensing systems)來感受群體的密度，做出基因介導(dǎo)的信號(hào)響應(yīng)并產(chǎn)生毒性因子，包括抗生素。金葡菌的agr基因座構(gòu)成了全面毒性響應(yīng)的一個(gè)方面。如圖2所示，由5個(gè)基因組成的agr操縱子指導(dǎo)合成的AgrC和AgrA蛋白，分別是跨膜感受激酶和響應(yīng)控制器［31］。AgrB是一個(gè)多肽輸出泵，作用于蛋白水解過程和自誘導(dǎo)肽(AIP)的成熟前體肽(agrD基因產(chǎn)物)的分泌。蛋白水解和分泌后，AIP就成為了AgrC的外來配體，開啟發(fā)育細(xì)胞和臨近發(fā)育細(xì)胞agr基因座的進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄。密度依賴型群體感應(yīng)作用是由AIP分泌濃度及其特異受體AgrC的多少來決定。

當(dāng)細(xì)菌群聚生長為生物膜，譬如在住院患者的各種導(dǎo)管內(nèi)，群體感應(yīng)系統(tǒng)就會(huì)成為細(xì)菌形態(tài)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的決定因素。在這種情況下，使用抗生素都難以控制細(xì)菌，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)菌多糖被膜的滲透性極差［32］。所以，更直接有效的抑制作用就是阻斷群體感應(yīng)器(quorum

圖2

金葡菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)(根據(jù)文獻(xiàn)［32］重繪) sensor)的生物合成，一些信號(hào)分子可激發(fā)生物膜的形成。如果一個(gè)多肽起信號(hào)分子作用，那么它就是產(chǎn)生自誘導(dǎo)前體肽的AgrD酶，或具有AgrB輸出泵的蛋白酶活性。一般情況下，革蘭陽性菌以?；呓z氨酸(acylhomoserine)［33］內(nèi)酯為細(xì)胞間群體信號(hào)感應(yīng)分子，所以可將LuxI族合成酶作為靶標(biāo)。Pseudomonas stewartii內(nèi)酯合成酶的X衍射結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明，為藥物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提供了好的開端。

3.5 外排泵作為靶點(diǎn)

為降低氟喹諾酮(fluoroquinolone)的外排，有人針對(duì)銅綠假單胞菌的MexA-MexB-OprM、MerC-MexD-OprJ和MexE-MexF-OprN外排泵(efflux pump)系統(tǒng)和大腸埃希菌的AcrA-AcrB-TolC外排泵，開展了外排泵阻遏劑的篩選。能阻遏外排泵的抑制物，可以降低細(xì)菌的內(nèi)源性耐藥和獲得性耐藥，也可以降低回旋酶耐藥變種出現(xiàn)的速率［34］。植物天然產(chǎn)物5′-甲氧基大風(fēng)子素D(methoxyhydncarpin D)就是這種具有阻斷氟喹諾酮泵出的活性阻遏物［35］，由于改變了外排泵的結(jié)構(gòu)而引起功能與活性的變化。類似地，四環(huán)素的結(jié)構(gòu)修飾物氯丙硫(chloropropylthio)四環(huán)素，可以阻遏Tet外排泵蛋白。新出現(xiàn)的甘氨酰四環(huán)素(glycylcycline)也是Tet外排泵蛋白阻遏物，它們甚至對(duì)具有核糖體保護(hù)蛋白因子TetM和TetO的菌株都有抑制活性［36］。同樣我們還可以開發(fā)出其他抗生素外排泵阻遏物。

4 展望

由于新藥研發(fā)費(fèi)用的不斷增長和新結(jié)構(gòu)藥物發(fā)現(xiàn)數(shù)量的逐年減少，藥物作用新靶點(diǎn)的研究已成為藥物相關(guān)研究的熱點(diǎn)。隨著化學(xué)信息學(xué)和基因組學(xué)的興起，新藥的研發(fā)模式也將發(fā)生革命性的改變。人們可以利用已知靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)基于結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的藥物設(shè)計(jì)，也可對(duì)未知結(jié)構(gòu)的新靶點(diǎn)進(jìn)行藥物分子藥效團(tuán)的統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行高通量篩選并發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物，加快新藥研發(fā)進(jìn)程?？傊?，研究者們采用各種新技術(shù)、新策略發(fā)掘新靶點(diǎn)，推出新的高效抗生素藥物，為人類重大疾病提供突破性治療，最終將帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

【參考文獻(xiàn)】

［1］ Andersson D I The biological cost of mutational antibiotic resistance: any practical conclusions? ［J］. Curr Opin Microbiol，2006，9(5):461～465.

［2］ Johnston N. Reversing the evolution of antibiotic resistance ［J］. Drug Discov Today，2005，10(19):1267.

［3］ 金少鴻，馬越. 國內(nèi)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測研究的回顧與展望［J］. 中國抗生素雜志，2005，30(5):257～259，283.

［4］ Pucci M J. Use of genomics to select antibacterial targets ［J］. Biochem Pharm，2006，71(7):1066～1072.

［5］ Rosamond J， Allsop A. Harnessing the power of genome in the search for new antibiotic ［J］. Science，2000，287(5460):1973～1976.

［6］ Hensel M， Shea J E， Gleeson C， et al. Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection ［J］. Science，1995，269(5222):400～403.

［7］ Kuroda M， Ohta T， Uchiyama I， et al. Whole genome sequencing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus ［J］. Lancet，2001，357(9264):1225～1240.

［8］ Mittl P R， Grutter M G. Structural genomics: opportunities and challenges ［J］. Curr Opin Struct Biol，2000，5(4):402～408.

［9］ Perego M， Hoch J A. Functional genomics of Gram-positive microorganism: review of the meeting， San Diego， California， 24 to 28 June 2001 ［J］. J Bacteriol，2001，183:6973～6978.

［10］ Mahan M J， Tobias J W， Slauch J M， et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(3):669～673.

［11］ Navarre W W， Schneewind O. Surface proteins of Gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope ［J］. Microbiol Mol Biol Rev，1999，63(1):174～229.

［12］ Ilangovan U， Ton-That H， Iwahara J， et al. Structure of sortase， the transpeptidase that anchors protein to the cell wall of Staphylococcus aureus ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(11):6056～6061.

［13］ van Heijenoort J. Formation of the glycan chains in the synthesis of bacterial peptidoglycan ［J］. Glycobiology，2001，11(3):25R～36R.

［14］ Ye X Y， Lo M C， Brunner L， et al. Better substrates for bacterial transglycosylases ［J］. J Am Chem Soc，2001，123(13):3155～3156.

［15］ Baizman E R， Branstrom A A， Longley C B. Antibacterial activity of synthetic analogues based on the disaccharide structure of monomycin， an inhibitor of bacterial transglycosylase ［J］. Microbiology，2000，146(12):3129～3140.

［16］ Sun B Z， Chen Z， Eggert U S， et al. Hybrid glycopeptide antibiotics ［J］. J Am Chem Soc，2001，123(50):12722～12723.

［17］ Belova L， Tenson T， Xiong L， et al. A novel site of antibiotic action in the ribosome: interaction of eveninomycin with the large ribosomal subunit ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(7):3726～3731.

［18］ Huntington K M， Yi T， Wei Y， et al. Synthesis and antibacterial activity of peptide deformylase inhibitors ［J］. Biochemistry，2000，39(15):4543～4551.

［19］ Nissen P， Hansen J， Ban N， et al. The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis ［J］. Science，2000，289(5481):920～930.

［20］ Poulsen S M， Kofoed C， Vester B. Inhibition of the peptidyl transferase reaction by the mycarose moiety of the antibiotics carbomycin， spiramycin and tylosin ［J］. J Mol Biol，2000，304(3):471～481.

［21］ Sinha R R， Gehring A M， Miline J C， et al. Thiazole and oxazole peptides: biosynthesis and molecular machinery ［J］. Nat Prod Rep，1999，16(2):249～263.

［22］ Apfel C M， Locher H， Evers S， et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: target validation and resistance development ［J］. Antimicrob Agents Chemo-ther，2001，45(5):1058～1064.

［23］ Silvian L F， Wang J， Steitz T A. Insight into editing from an Ile-tRNA synthetase structure with tRNAile and mupirocin ［J］. Science，1999，285(5430):1074～1077.

［24］ Cubbon M D， Masterton R G. New quinolones-a fresh answer to the pneumococcus ［J］. J Antimicrob Chemo-ther，2000，46(6):869～872.

［25］ Schmitz F J， Fluit A C， MIlatovic D， et al. In vitro potency of moxifloxacin， clinafloxacin and sitafloxacin against 248 genetically defined clinical isolate of Staphylococcus aureus ［J］. J Antimicrob Chemother，2000，46(1):109～113.

［26］ Silverman E， Edwalds-Gilbert G， Lin R J. DExD/H-box proteins and their partners: helping RNA helicases unwind ［J］. Gene，2003，312(17):1～16.

［27］ Allen N E. Nonclassical targets for antibacterial agents ［J］. Annu Rep Med Chem，1985，20:155～162.

［28］ Mckinney J D， Honer B K， Munoz-Elias E J， et al. Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase ［J］. Nature，2000，406(6797):735～738.

［29］ Barrett J F， Hoch J A. Two-component signal transduction as a target for microbial anti-infective therapy ［J］. Antimicrob Agents Chemother，1998，42(7):1529～1536.

［30］ Throup J P， Zappacosta F， Lunsford R D， et al. The srhSR gene pair from Staphylococcus aureus: genomic and proteomic approaches to the identification and characterization of gene function ［J］. Biochemistry，2001，40(34):10392～10401.

［31］Otto M. Quorum-sensing control in staphylococci-a target for antimicrobial drug therapy? ［J］. FEMS Microb Lett，2004，241(2):135～141.

［32］ Miller M B， Bassler B I. Quorum sensing in bacteria ［J］. Annu Rev Microbiol，2001，55:165～199.

［33］ Hanzelka B L， Parsek M R， Val D L， et al. Acylhomoserine lactone synthase activity of the Vibrio fischeri AinS protein ［J］. J Bacterial，1999，181(18):5766～5770.

［34］ Lomovskaya O， Warren A T， Lee A， et al. Identification and characterization of inhibitors of multidrug resistance efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa: novel agents for combination therapy ［J］. Antimicrob Agents Chemother，2001，45(1):105～116.

［35］ Stermitz F R， Lorenz P， Tawara J N， et al. Synergy in a medical plant: antimicrobial action of berberine poten-tiated by 5′-methoxyhydnocarpin， a multidrug pump inhibitor ［J］. Proc Natl Sci USA，2000，97(4):1433～1437.