導(dǎo)語：如何才能寫好一篇基因突變，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

基因突變是基因組DNA分子發(fā)生的突然的、可遺傳的變異現(xiàn)象。

從分子水平上看，基因突變是指基因在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變。基因雖然十分穩(wěn)定，能在細胞分裂時精確地復(fù)制自己，但這種穩(wěn)定性是相對的。在一定的條件下基因也可以從原來的存在形式突然改變成另一種新的存在形式，就是在一個位點上，突然出現(xiàn)了一個新基因，代替了原有基因，這個基因叫做突變基因。于是后代的表現(xiàn)中也就突然地出現(xiàn)祖先從未有的新性狀?；蛲蛔兛梢园l(fā)生在發(fā)育的任何時期，通常發(fā)生在DNA復(fù)制時期，即細胞分裂間期，包括有絲分裂間期和減數(shù)分裂間期。

（來源：文章屋網(wǎng) ）

篇2

不知為什么，我總覺得他有用不完的活力。整天嘻嘻哈哈的，給人以不務(wù)正業(yè)的感覺，就拿早上交作業(yè)這種芝麻綠豆大的小事來說他吧！

一大早，我都還沒到學(xué)校，他就已經(jīng)早早地坐在位子上了。一般來說只要一到學(xué)校就應(yīng)該先把所有作業(yè)本交掉，可是這位大少爺從來沒有過?淥??匕炎饕到蝗???蓯且?乙歡?僭俁??么咚?趴習(xí)炎饕到懷隼礎(chǔ)S惺鋇攘慫?習(xí)胩歟??詈缶谷幻蛔觶?饋??媸且?凰??帽??芰恕U嫻姑刮揖固?狹蘇餉匆桓鱟樵保。。。。

更氣人的是在上一次的美術(shù)課上，老師要求我們畫一幅可以突出別人外表特點的畫，而且要畫同班同學(xué)呢！可惡的可恨的陳甲森，他最喜歡笑話人了。在別人畫完后，他就開始了他的“點評”有說別人畫的像豬的，猴子的……還笑別人的畫有多么難看。真是有多可惡就有多可惡！我就沒看到他畫的畫有多么好看。我原本也想奚落一下他的畫的，可是還沒說出口，他就先說：“其實畫繆藝是最簡單的了，只要用圓規(guī)畫就可以了?！比缓蠊笮ζ饋?。我知道他是什么意思，不就說我的臉很圓很胖嘛！等等，他的意思是說我的臉很圓很胖。呀！這個該死的陳甲森，如果殺人不犯法的話，他恐怕已經(jīng)被我殺個幾千次了。

篇3

【關(guān)鍵詞】基因突變 染色體變異

[Abstract] This essay discusses the differences in the chromosome formation the cause and the results between gene mutation and chromos omestructure variation

[Keywords]Gene mutationchromosomevariation

我們在學(xué)習(xí)生物變異一節(jié)時，學(xué)到了基因突變和染色體結(jié)構(gòu)變異，很多學(xué)生在做具體題時二者總是混，分不清?，F(xiàn)將二者的區(qū)別簡單加以介紹。

基因突變和染色體結(jié)構(gòu)變異均是可遺傳的變異，在遺傳中表現(xiàn)出子代性狀與親代性狀不同，出現(xiàn)親代、祖代從來沒有過的新性狀，且這種性狀能在后代中重新出現(xiàn)，可見是遺傳物質(zhì)發(fā)生變化了。兩者區(qū)別表現(xiàn)在：

1 染色體形態(tài)

1.1、基因突變是單個基因內(nèi)部發(fā)生變化，從而引起該基因所控制的性狀產(chǎn)生不同于親代的變化。在光學(xué)顯微鏡下也看不到染色體形態(tài)的變化。

1.2、染色體結(jié)構(gòu)變異是某個染色體在結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化，在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到染色體形態(tài)的改變。

2 產(chǎn)生的原因

2.1、基因突變是DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生偶然差錯，個別堿基缺失，增添或替換使基因中相關(guān)核苷酸的種類、數(shù)量、排列順序發(fā)生改變，因而改變了遺傳信息。例如，鐮刀形細胞貧血癥。

2.2、染色體結(jié)構(gòu)變異是由于外界因素作用，染色體發(fā)生斷裂和重新組合而造成染色體結(jié)構(gòu)變化，改變遺傳信息，我們課本提到了結(jié)構(gòu)變異的四種情況（缺失、易位、倒位、重復(fù)）貓叫綜合癥是人體第五號染色體短辟上的缺失引起的疾病。

3結(jié)果不同

3.1、基因突變是不定向的，結(jié)果產(chǎn)生等位基因，如基因A可突變a，也可以突變?yōu)閍1、a2、a3、 ……,a也可以突變成A。即同一性狀在不同生物個體中發(fā)生突變后有不同的表現(xiàn)。例如，刮大風(fēng)海島上有翅昆蟲可突變長翅和殘翅昆蟲。

3.2、染色體相同的結(jié)構(gòu)變異后表現(xiàn)出的生物性狀在不同生物個體均相同。如貓叫綜合癥，患兒都表現(xiàn)兩眼距離較寬，反應(yīng)遲鈍，往往過早夭折，哭聲似貓叫。

篇4

[關(guān)鍵詞] 非小細胞肺癌；KRAS基因突變；抑制KRAS下游效應(yīng)分子；靶向治療

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（a）-0032-04

Progress in targeted therapy of KRAS mutations in non-small cell lung cancer

ZHANG Yukun GE Wei

The Two Department of Oncology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Lung cancer is one of the most deadly malignancies， ranking the first in global cancer-related death. With the development of multidisciplinary comprehensive treatment， the mortality rate of patients with lung cancer is still high. KRAS gene mutations are the most common type of mutations in non-small cell lung. At present， the targeted therapy of KRAS gene mutation mainly through the direct inhibition of KRAS gene， change the KRAS membrane localization， inhibition of KRAS downstream effector molecules， inhibition of KRAS mutant synergistic lethal genes and other aspects of research. In this review， the status and progress of KRAS mutations in non-small cell lung cancer targeted therapy are briefly reviewed.

[Key words] Non-small cell lung cancer； KRAS gene mutation； Inhibition of KRAS downstream effector molecule； Targeting therapy

肺癌居世界范圍內(nèi)惡性腫瘤死因的第一位，每年有超過100萬人因肺癌死亡[1]。其中非小細胞肺癌（NSCLC）是最常見的組織學(xué)類型，占所有肺癌的85%[2]。超過40%的患者確診時已是局部晚期或晚期，失去了手術(shù)機會。目前肺癌的治療逐漸多元化，包括手術(shù)、放化療、靶向治療、生物免疫治療等，對于晚期NSCLC的一線化療方案是以鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合，但其療效已經(jīng)達到治療平臺，隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，分子靶向治療為NSCLC患者帶來了新的希望。靶向表皮生長因子受體（EGFR）和間變性淋巴瘤激酶（ALK）已廣泛應(yīng)用于NSCLC的治療中。然而，10%～30% KRAS突變型肺癌患者無法從EGFR抑制劑中獲益。此外，盡管早已確定了NSCLC中存在KRAS突變，但這仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的靶向治療目標。

1 治療方法

1.1 直接抑制KRAS基因

直接抑制KRAS基因已經(jīng)被證明在臨床上是有困難的。但也有學(xué)者通過抑制KRAS G12C和GTP結(jié)合，促進其與GDP的結(jié)合，及抑制KRAS和其下游效應(yīng)分子Braf結(jié)合來抑制KRAS基因的活性，如，Ostrem等[3]發(fā)現(xiàn)了一個KRAS G12C突變體特異性抑制劑，該抑制劑能有效抑制KRAS G12C突變體和GTP結(jié)合，促進其與GDP的結(jié)合，使突變KRAS基因失活。Lim等[4]報道了另一個KRAS G12C抑制劑，在不影響正常KRAS的情r下特異性結(jié)合突變的KRAS基因，使突變的KRAS失去活性。

1.2 改變KRAS膜定位

抑制KRAS膜定位，包括多種酶，如法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑（FTIs）、香葉基轉(zhuǎn)移酶、RAS轉(zhuǎn)換酶1（RCE1）、ICMT。第1代FTIs如Tipifarnib和Lonafarnib，雖然耐受性良好，但表現(xiàn)出較差的臨床效應(yīng)。盡管缺乏有效性認為是由于香葉基轉(zhuǎn)移酶對KRAS基因選擇性異戊烯化，但FTIs和香葉基轉(zhuǎn)移酶的雙重抑制也沒有任何效果[5]。第2代FTIs如Salirasib[6]，在臨床上對肺癌患者無效。這種無效性可能通過香葉基轉(zhuǎn)移酶對KRAS基因選擇性異戊烯化或選擇性耐藥機制來解釋，如KRAS基因擴增或脫靶效應(yīng)[7]。此外，一些RCE1和ICMT抑制劑，已在小鼠模型中有了可喜的成果，但是這些藥物還需進一步優(yōu)化才能進行人體試驗。

1.3 抑制KRAS下游效應(yīng)分子

1.3.1 PI3K PI3K是KRAS下游的一種胞質(zhì)分子，也是PI3K/AKT/mTOR通路的一部分，它是一個多途徑融合的位點。在NSCLC中發(fā)現(xiàn)約2%的PI3KCA突變。PI3K通路也可以通過PTEN的缺失、上游酪氨酸激酶受體擴增或KRAS基因突變被上調(diào)[8]。新型PI3K抑制劑（例如BKM120、GDC0941和XL147）在第一階段臨床試驗中開發(fā)并初步顯示出有希望的結(jié)果。這些藥物目前正用于PI3KCA突變的晚期NSCLC患者進行的Ⅱ期臨床試驗（NCT01297491、NCT01493843）中。然而，盡管KRAS基因活性依賴于下游PI3K活性，但初步數(shù)據(jù)表明，KRAS突變的腫瘤對PI3K抑制劑單藥治療是不敏感的[9]。因此，單獨抑制PI3K通路治療KRAS突變的NSCLC是不足的，可嘗試給予多個KRAS下游信號通路的抑制劑聯(lián)合治療。

1.3.2 BRAF BRAF是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可直接作用于結(jié)合GTP的KRAS基因及激活BRAF/MEK/ERK/MAPK途徑。BRAF基因突變在NSCLC中占1%～4%，其中50%的突變?yōu)閂600E[10]。BRAF抑制劑達拉菲尼（Dabrafenib）和危羅菲尼（Vemurafenib），首先在BRAFV600E突變的黑色素瘤中做了研究，而且黑色素瘤V600E突變占BRAF突的百分比超過80%[11-12]，研究證明V600E BRAF突變的晚期NSCLC中，Dabrafenib估計反應(yīng)率為40%[13]。一開放標簽，多中心Ⅱ期臨床試驗中（NCT01336634），Dabrafenib加曲美替尼（Trametinib）治療BRAF突變（V600E）的NSCLC可達到50%總反應(yīng)率，且中位無進展生存期>9個月。Dabrafenib加Trametinib治療BRAF突變（V600E）的NSCLC是很有前途的新療法，可獲得較高的總療效，更可觀的是延長了DOR[14]。

1.3.3 mTOR 在PI3K/AKT/mTOR中，mTOR是另外一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，也是PI3K家族的成員。臨床前數(shù)據(jù)表明，在KRAS基因突變的肺腺癌小鼠模型中，抑制mTOR基因可抑制腫瘤的生長[15]。一些mTOR抑制劑（例如依維莫司、Ridaforolimus）已在NSCLC的治療研究獲得了有前景的結(jié)果。一個Ⅱ期臨床試驗，70例患者KRAS突變的NSCLC患者接受Ridaforolimus治療8周，在8周后，28例患者病情是穩(wěn)定的，隨后被隨機分配接受安慰劑或繼續(xù)維持Ridaforolimus治療。最終，接受Ridaforolimus治療的PFS是明顯高于安慰劑組（4個月和2個月，HR=0.36，P=0.013），而且其OS有一個更好的趨勢（18個月和5個月，HR=0.46，P=0.009）[16]。但是Ridaforolimus治療的臨床推廣，仍需要更大型的Ⅲ期臨床實驗來進一步驗證其在改善PFS、OS上的作用。

1.3.4 MEK 在RAS/RAF/MEK/ERK通路中，MEK蛋白激酶是KRAS和BRAF下游信號，也被稱為MAP激酶級聯(lián)。磷酸化BRAF激活絲氨酸/蘇氨酸激酶MEK，進而激活絲氨酸/蘇氨酸激酶ERK，從而激活轉(zhuǎn)錄因子促進細胞周期進程和細胞增殖[17]。已經(jīng)開發(fā)的幾個小分子選擇性抑制MEK，如CI-1040、RO5126766和PD-0325901，都沒有較好的臨床療效。最近，其他MEK-1和MEK-2抑制劑已被開發(fā)，如司美替尼和Trametinib已用于KRAS突變的NSCLC治療研究中。在臨床前期研究中，司美替尼對BRAF和KRAS突變的細胞系有生長抑制作用，而且在體內(nèi)實驗也證明，司美替尼可抑制小鼠皮下異種移植瘤的生長。通過Ⅰ期臨床實驗確定了司美替尼的口服劑量為100 mg，每日兩次。在對未經(jīng)篩選的NSCLC患者進行的一些Ⅱ期研究中，比較司美替尼與培美曲塞在作為二線及三線方案的療效，雖然其起到了一定的臨床療效，但與培美曲塞相比在延長生存期上沒有優(yōu)勢。這表明進一步研究需要在BRAF或KRAS突變的NSCLC患者中研究?；谂R床前期實驗及報告的在服用司美替尼后出現(xiàn)的不良事件（腹瀉、惡心、嘔吐等）的條件下，對KRAS突變的NSCLC患者進行了一個Ⅱ期臨床實驗，比較司美替尼聯(lián)合多西紫杉醇與多西紫杉醇單藥治療的效果，聯(lián)合組大大提高了反應(yīng)率（37%和0%，P < 0.01）和PFS（5.3個月和2.1個月，P=0.014），但是OS并沒有明顯改善（9.4個月和2.1個月，P=0.21）[18]。進而對KRAS突變的NSCLC患者進行了Ⅲ期臨床試驗，比較多西他賽加司美替尼與多西他賽單藥化療的療效，但是并沒有明顯改善RR、PFS或OS[19]。司美替尼/多西他賽Ⅱ期試驗亞組分析表明，G12C突變使用司美替尼治療可能比其他突變型有更高的反應(yīng)率和PFS[20]。也有研究證明司美替尼聯(lián)合厄洛替尼治療KRAS突變型或野生型NSCLC，與厄洛替尼單藥治療相比，預(yù)后并無改善。

KRAS基因可以激活PI3K/AKT/mTOR和BRAF/MEK/ERK通路，因此抑制這兩條信號通路可能需要完全阻斷KRAS基因，有一些前期臨床實驗嘗試了PI3K抑制劑或MEK抑制劑聯(lián)合mTOR抑制劑治療NSCLC，患者有較好的耐受性，但這些結(jié)果需要行Ⅱ期臨床實驗來進一步論證，但也給治療NSCLC帶來了新思路。

1.4 抑制KRAS突變協(xié)同致死基因

KRAS突變可使癌細胞獲得特殊的生物學(xué)行為，即其生長和存活依賴于其他協(xié)同基因的共同作用，因而抑制這些基因能殺死KRAS突變的癌細胞 ，所以抑制這些協(xié)同致死基因是殺死腫瘤細胞的一個間接、有效的策略。這些因子有很多，包括WT1、GATA2或參與NF-κB通路的小分子，并對這些因子作為靶點及特異性抑制劑做了一些臨床前期研究。Vicent等[21]分析了大量樣本，發(fā)現(xiàn)WT1基因高表達可能參與KRAS突變的致瘤作用。Kumar等[22]發(fā)現(xiàn)GATA-2是這些KRAS突變NSCLC腫瘤細胞存活所必要的基因。硼替佐米是NF-κB的蛋白酶體抑制劑，目前主要用于多發(fā)性骨髓瘤的治療。在對16例KRAS G12D突變的肺腺癌進行的Ⅱ期研究中發(fā)現(xiàn)，患者的中位生存期達到了13個月[23]。

此外，Puyol等[24]在NSCLC的小鼠腫瘤模型中，發(fā)現(xiàn)KRAS基因和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）有合成致死效應(yīng)。Mao等[25]利用KRAS與CDK4基因之間的合成致死效應(yīng)，使用攜載有針對CDK4siRNA（siCDK4）的混合膠束顆粒對荷瘤小鼠進行治療。結(jié)果顯示，攜載有siCDK4的KRAS突變的腫瘤生長有顯著抑制效果，KRAS野生型的腫瘤生長則沒有受到顯著影響，證實該治療方案的特異性、高效性和安全性，為進一步開發(fā)針對KRAS突變的siRNA藥物提供了新策略。

1.5 其他

MET是一跨膜酪氨酸激酶受體，主要在腫瘤侵襲、增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，也可以參與激活KRAS信號通路。在肺腺癌中MET擴增約4%，通過激活RAS/PI3K/AKT/mTOR通路，導(dǎo)致EGFR-TKIs獲得性耐藥。在所有NSCLC的研究中MET作為靶點及KRAS信號激活劑做了研究，目前對肺癌效果較好的抑制劑包括小分子c-Met受體酪氨酸激酶抑制劑（Tivantinib）及MET受體單克隆抗體（onartuzumab）。有研究顯示，Tivantinib聯(lián)合厄洛替尼并沒有改善晚期NSCLC患者的預(yù)后，但患者的PFS有明顯的改善（P < 0.01）[26]。雖然Ⅲ期研究因缺乏療效過早終止，但初步分析亞組似乎證實了上述結(jié)果。一個初期的Ⅱ期研究表明，onartuzumab聯(lián)合厄洛替尼治療MET陽性的NSCLC患者，有較好的預(yù)后[27]。

熱休克蛋白（HSP）是分子伴侶，參與蛋白質(zhì)的翻譯后折疊和合成。HSP90抑制劑可干擾致癌驅(qū)動基因的正常功能，包括突變的EGFR、BRAF、HER2和EML4-ALK。有研究報道，HSP90抑制劑ganetespib聯(lián)合多西他賽治療KRAS突變的NSCLC，未能改善患者的PFS和OS，且HSP90抑制劑ganetespib聯(lián)合MEK和PI3K/mTOR抑制劑的研究中發(fā)現(xiàn)，其加大了對KRAS突變細胞的細胞毒活性[28]。

局部黏著斑激酶（FAK）也作為治療的靶點被研究過，主要黏附于細胞外基質(zhì)。其中KRAS-RHOA-FAK通路在TP53滅活和CDKN2A缺失的肺癌中，與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。一個Ⅱ期臨床研究評估FAK抑制劑：VS-6063（Defactinib）對KRAS突變型NSCLC（NCT01951690）的療效，得到了極低的反應(yīng)率（1/44例），但是12周的PFS率為36%，因此，研究人員認為該抑制劑是有研究前景的[29]。

2 展望

盡管隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展，肺癌的治療取得了飛速發(fā)展，尤其是NSCLC的靶向治療取得了突破性的進展，但對于KRAS基因突變的NSCLC靶向治療仍然是一個具有挑戰(zhàn)及吸引力的靶向治療目標。但是抑制KRAS下游效應(yīng)分子（PI3K、BRAF、mTOR、MEK）顯現(xiàn)出令人期待的發(fā)展前景，特別是下游效應(yīng)分子抑制劑聯(lián)合使用會有較大的發(fā)展空間，我相信在不久的將來針對KRAS基因的靶向治療會為NSCLC患者帶來更有效的治療。

[參考文獻]

[1] Boffetta P，Boccia S，Vecchia CL. A quick guide to cancer epidemiology [M]. Springer Int Publishing，2014，35（2）：11-14.

[2] Zappa C，Mousa SA. Non-small cell lung cancer：current treatment and future advances [J]. Transl Lung Cancer Res，2016，5（3）：288-300.

[3] Ostrem JM，Peters U，Sos ML，et al. KRAS（G12C）inhibitors allosterically control GTP affinity and effector interactions [J]. Nature，2013，503（7477）：548-551.

[4] Lim SM，Westover KD，F(xiàn)icarro SB，et al. Therapeutic targeting of oncogenic KRAS by a covalent catalytic site inhibitor [J]. Angew Chem Int Ed Engl，2014，53（1）：199-204.

[5] Lobell RB，Liu D，Buser CA，et al. Preclinical and clinical pharmacodynamic assessment of L-778，123，a dual inhibitor of farnesyl：protein transferase and geranylgeranyl：protein transferase type-Ⅰ [J]. Mol Cancer Ther，2002，1（1）：747-758.

[6] Basso AD，Kirschmeier P，Bishop WR. Thematic review series：lipid posttranslational modifications. Farnesyl transferase inhibitors [J]. J Lipid Res，2006，47（1）：15-31.

[7] Tomasini P，Walia P，Labbe C，et al. Targeting the KRAS pathway in non-small cell lung cancer [J]. Oncologist，2016， 21（12）：1-11.

[8] Bosse T，terHaar NT，Seeber LM，et al. Loss of ARID1A expression and its relationship with PI3K-Akt pathway alterations，TP53 and microsatellite instability in endometrial cancer [J]. Mod Pathol，2013，26（11）：1525-1535.

[9] Mashima T，Ushijima M，Matsuura M，et al. Comprehensive transcriptomic analysis of molecularly targeted drugs in cancer for target pathway evaluation [J]. Cancer Sci，2015， 106（7）：909-920.

[10] Litvak AM，Paik PK，Woo KM，et al. Clinical characteristics and course of 63 patients with BRAF mutant lung cancers [J]. J Thorac Oncol，2014，9（11）：1669-1674.

[11] Sosman JA，Johnson DB. Clinical utility of BRAF targeted therapy in melanoma [J]. Cancer Drug Discovery Development，2015，82（6）：67-84.

[12] Hauschild A，Grob JJ，Demidov LV，et al. Dabrafenib in BRAF mutated metastatic melanoma：a multicentre，open-label，phase 3 randomised controlled trial [J]. Lancet，2012， 380（9839）：358-365.

[13] Planchard D，Mazieres J，Riely GJ，et al. Interim results of phase Ⅱ study BRF113928 of dabrafenib in BRAF V600E mutation-positive non-small cell lung cancer （NSCLC） patients [J]. J Clin Oncol，2013，44（1）：114-143.

[14] Planchard D，Besse B，Groen HJM，et al. Dabrafenib plus trametinib in patients with previously treated BRAF V600E mutant metastatic non-small cell lung cancer：an open-label，multicentre phase 2 trial [J]. Lancet Oncol，2016，17（7）：984-993.

[15] Wislez M，Spencer ML，Izzo JG，et al. Inhibition of mammalian target of rapamycin reverses alveolar epithelial neoplasia induced by oncogenic KRAS [J]. Cancer Res，2005，65（8）：3226-3235.

[16] Riely GJ，Brahmer JR，Planchard D，et al. Arandomized discontinuation phase Ⅱ trial of ridaforolimusin non-small cell lung cancer （NSCLC） patients with KRAS mutations [J]. J Clin Oncol，2012，30（suppl）：7531a.

[17] Schubbert S，Shannon K，Bollag G. Hyperactive RAS in developmental disorders and cancer [J]. Nat Rev Cancer，2007，7（4）：295-308.

[18] J？]nne PA，Shaw AT，Pereira JR，et al. Selumetinib plus docetaxel for KRAS-mutant advanced non-small cell lung cancer：a randomised，multicentre，placebo-controlled，phase 2 study [J]. Lancet Oncol，2013，14（1）：38-47.

[19] J？]nne PA，Mann H，Ghiorghiu D. Study design and rationale for a randomized，placebo-controlled，double-blind study to assess the efficacy and safety of selumetinib in combination with docetaxel as second-line treatment in patients with KRAS-mutant advanced non-small cell lung cancer （SELECT-1） [J]. Clin Lung Cancer，2016， 17（2）：e1-e4.

[20] J？]nne P A，Smith I，Mcwalter G，et al. Impact of KRAS codon subtypes from a randomised phase Ⅱ trial of selumetinib plus docetaxel in KRAS mutant advanced non-small cell lung cancer [J]. Br J Cancer，2015，113（2）：199-203.

[21] Vicent S，Chen R，Sayles LC，et al. Wilms tumor 1（WT1）regulates KRAS driven oncogenesis and senescence in mouse and human models [J]. J Clin Invest，2010， 120（11）：3940-3952.

[22] Kumar MS，Hancock DC，Molina-Arcas M，et al. The GATA2 transcriptional network is requisite for RAS oncogene driven non-small cell lung cancer [J]. Cell，2012， 149（3）：642-655.

[23] Litvak AM，Drilon AE，Rekhtman N，et al. Phase Ⅱ trial of bortezomib in KRAS G12D mutant lung cancers [J]. J Clin Oncol，2015，33（16）：161-171.

[24] Puyol M，Martín A，Dubus P，et al. A synthetic lethal interaction between KRAS oncogenes and CDK4 unveils a therapeutic strategy for non-small cell lung carcinoma [J]. Cancer Cell，2010，18（6）：63-73.

[25] Mao CQ，Xiong MH，Liu Y，et al. Synthetic lethal therapy for KRAS mutant non-small cell lung carcinoma with nanoparticle-mediated CDK4 siRNA delivery [J]. Mol Ther，2014，22（5）：964-973.

[26] Squist LV，von Pawel J，Garmey EG，et al. Randomized phase Ⅱ study of erlotinib plustivantinib versus erlotinib plus placebo in previously treated non-small cell lung cancer [J]. J Clin Oncol，2011，29（24）：3307-3315.

[27] Spigel DR，Ervin TJ，Ramlau RA，et al. Randomized phase Ⅱ trial of Onartuzumab in combination with erlotinib in patients with advanced non-small cell lung cancer [J]. J Clin Oncol，2013，31（32）：4105-4114.

[28] Acquaviva J，Smith DL，Sang J，et al. Targeting KRAS mutant non-small cell lung cancer with the Hsp90 inhibitor ganetespib [J]. Mol Cancer Ther，2012，11（2）：2633-2643.

篇5

【關(guān)鍵詞】 角膜營養(yǎng)不良，遺傳性;，基因;，突變;，序列分析，DNA;，聚合酶鏈反應(yīng);，系譜

摘要:目的 以基因突變分析一角膜營養(yǎng)不良家系的致病分子基礎(chǔ)。方法 應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接DNA測序及限制性內(nèi)切酶分析檢測家系中7例患者和6例表型正常成員的K3、K12和BIGH3基因突變情況。結(jié)果 該家系患者成員在K3與K12基因的編碼序列區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)突變，而BIGH3基因外顯子12存在CGG>TGG(R555W)突變雜合子，家系表現(xiàn)正常成員及正常對照均無BIGH3基因突變;限制性內(nèi)切酶分析結(jié)果顯示突變與疾病表現(xiàn)型呈完全共分離。結(jié)論　利用基因突變分析確診我國首例報道的Meesmann角膜營養(yǎng)不良家系屬于顆粒狀角膜營養(yǎng)不良，且為BIGH3 R555W雜合突變類型。

關(guān)鍵詞: 角膜營養(yǎng)不良，遺傳性; 基因; 突變; 序列分析，DNA; 聚合酶鏈反應(yīng); 系譜

ABSTRACT: Objective Molecular genetic analysis of a large Chinese corneal dystrophy kindred. Methods Thirteen inpiduals including seven affected and six unaffected family members in this granular corneal dystrophy kindred were studied. Genomic DNA was purified from blood peripheral leukocytes. All of the exons of both the Keratin3 and the keratin12 genes， and the exon 4 and exon 12 of BIGH3 gene were amplified using polymerase chain reaction(PCR)， followed by direct bidirectional sequencing for mutation detection.

The mutation was confirmed by restriction digest analysis. Results Direct sequencing of the patients' genomic DNA revealed there was no mutation in all of the exons of K3 and K12 genes， but a missense mutation(CGG>TGG) in the exon12 of BIGH3(R555W) was found. This mutation in this family completely cosegregates with the disease phenotype. Conclusion This kindred was diagnosed with granular corneal dystrophy harbored a heterozygous R555W mutation of the BIGH3 gene.

KEY WORDS:corneal dystrophy，hereditary; genes; mutation; polymerase chain reaction

基金項目: 福建省自然科學(xué)基金資助項目(C0510009)，福建醫(yī)科大學(xué)科學(xué)研究發(fā)展基金資助項目(FJGXY04020)

角膜營養(yǎng)不良(corneal dystrophy)是一組與遺傳有關(guān)的原發(fā)性、具有病理學(xué)組織學(xué)特征的疾病。目前，已確定與角膜營養(yǎng)不良的致病基因有BIGH3、CHST6、K3、K12、M1S2和GSN等。BIGH3基因突變至少可導(dǎo)致4種類型的角膜營養(yǎng)不良，包括顆粒狀角膜營養(yǎng)不良(R555W)、Avellino角膜營養(yǎng)不良(R124H)、格子狀角膜營養(yǎng)不良(R124C)和ThielBehnke角膜營養(yǎng)不良(R555Q)[1]。K3和K12基因突變導(dǎo)致Meesmann角膜營養(yǎng)不良[2]。筆者研究的家系為福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科普查時發(fā)現(xiàn)，先證者在裂隙燈下檢測可見雙角膜中央?yún)^(qū)有散在的細小圓形小泡，位于上皮層，斜照時呈散在的灰白點狀，后照亮下呈透明小氣泡樣，臨床表現(xiàn)為Meesmann角膜營養(yǎng)不良[3]。2004年，筆者隨訪該家系，家系圖譜表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳;在裂隙燈下檢測先證者，發(fā)現(xiàn)不僅角膜上皮層受累，而且累及角膜實質(zhì)層，臨床表現(xiàn)為顆粒狀或Avellino角膜營養(yǎng)不良。筆者對該家系進行分子遺傳學(xué)分析，以確定其類型與致病分子機制。

1 對象與方法

1.1　對象

家系3代38人，受累患者12人，獲得其中7例受累患者和6例非受累正常家系成員的血樣標本，10例無眼疾正常人的血樣標本作為正常對照組(圖1)。:獲取血樣標本的家系成員.

1.2 試劑和儀器

PCR所用試劑、瓊脂糖凝膠、溴化乙錠(EB)、BstXⅠ和DNA分子量標記等(大連寶生物公司);PCR擴增BIGH3基因外顯子12的引物序列: BIGH3e12F:5’CAGCGTGGTGAGGTATTTAAGG3　BIGH3e12R:5’GTAGTAAAGGCTTCCCAGGGTT3’

1.3 基因組DNA提取

取外周血樣3 mL，置于EDTAK3抗凝的真空采血管中;按Wizard Genome DNA Purification Kit(Promega)說明書提取基因組DNA。

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

PCR反應(yīng)體系25 μL，包括10×PCR緩沖液(20 mmol/L Mg2＋plus)2.5 μL、dNTP mix(2.5 mmol/L each)1 μL、PCR上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μL、基因組DNA(約100 ng)1 μL和TakaRa Ex TaqTM 0.25 μL、ddH2O補足25 μL;PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 3 min94 ℃ 30 s55 ℃ 30 s72 ℃ 30 s，30個循環(huán);72 ℃ 3 min。

1.5 PCR產(chǎn)物直接測序

2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物特異性后，PCR產(chǎn)物直接送大連寶生物公司測序。

1.6 限制性內(nèi)切酶分析

BIGH3 R555W位點突變產(chǎn)生一個新的限制性內(nèi)切酶位點，可被BstXⅠ識別(BstXⅠ識別序列為:CCANNNNN/NTGG);酶切反應(yīng)體系20 μL，45 ℃ 3 h。

2 結(jié)果

2.1 K3和K12基因突變檢測

Meesmann角膜營養(yǎng)不良是由K3和K12基因突變所致，且目前發(fā)現(xiàn)的突變?nèi)糠植荚贙3和K12角蛋白高度保守區(qū)HIM(helix initiation motifs)和HTM(helix termination motif)區(qū)域[2，4]。首先篩查文獻已報道的K3和K12基因突變區(qū)域，即K12基因的外顯子1和外顯子6以及K3基因的外顯子7。DNA測序結(jié)果表明在這些區(qū)域沒有突變，進一步掃描K3和K12基因整個外顯子區(qū)域，也未發(fā)現(xiàn)突變。2004年隨訪，裂隙燈檢測發(fā)現(xiàn)癥狀發(fā)生改變，先證者的臨床表現(xiàn)可能為顆粒狀或Avellino角膜營養(yǎng)不良(圖2)。

2.2BIGH3基因突變檢測

PCR擴增BIGH3基因外顯子4和外顯子12，DNA直接測序分析，結(jié)果顯示患者(先證者Ⅱ7和Ⅲ1)在BIGH3基因的外顯子12發(fā)生雜合突變(CGG>TGG)，即BIGH3 R555W突變(圖3A);另外，在兩位患者的BIGH3基因外顯子12還發(fā)現(xiàn)一個多態(tài)位點(Phe540Phe)(圖3B);內(nèi)切酶BstXⅠ分析結(jié)果顯示該家系的BIGH3 R555W突變與疾病表現(xiàn)型呈完全共分離(圖3C)，表明該例Meesmann角膜營養(yǎng)不良家系屬顆粒狀角膜營養(yǎng)不良，且為BIGH3基因R555W突變雜合子。

3 討論

角膜營養(yǎng)不良一般依據(jù)病史和裂隙燈檢測可作出初步的臨床診斷，且主要按病變發(fā)生的解剖學(xué)部位將其分為前部、實質(zhì)部和后部角膜營養(yǎng)不良三類。然而，在進行性病變過程中，角膜營養(yǎng)不良還表現(xiàn)一個共同特點，即開始先侵犯角膜的某一層，晚期可波及鄰近層次，甚至影響全層角膜。因此， A:DNA測序分析突變位點; B:BIGH3單核苷酸多態(tài)性位點(T/C); C:限制性內(nèi)切酶BstXⅠ分析.

在臨床診斷分型，特別是晚期患者的診斷分型帶來很大的混淆。隨著角膜營養(yǎng)不良分子遺傳學(xué)的深人研究，以致病基因的分子特征作為臨床診斷和分類、分型的依據(jù)，其可靠性和準確性也得到了大大提高，并且越來越受到國內(nèi)外同行們的廣泛認可。

Meesmann角膜營養(yǎng)不良屬于前部角膜營養(yǎng)不良，臨床表現(xiàn)主要為角膜上皮層內(nèi)散在著無數(shù)細小圓形透明囊泡，是由K3或K12基因突變所致[2]。顆粒狀角膜營養(yǎng)不良屬實質(zhì)部角膜營養(yǎng)不良，依據(jù)角膜表征目前至少可以分為3種類型：Avellino角膜營養(yǎng)不良、典型顆粒狀角膜營養(yǎng)不良和淺表變異型顆粒狀角膜營養(yǎng)不良，分別是由于BIGH3基因的R124H、R555W和R124L突變所致[5]。目前，在世界各國的相關(guān)研究中均發(fā)現(xiàn)BIGH3基因的第4外顯子的R124和第12外顯子的R555為突變熱點;與BIGH3基因R555W突變相關(guān)的顆粒狀角膜營養(yǎng)不良患者在歐洲和美國較為常見，在日本卻較為少見[1]。

分子遺傳學(xué)分析結(jié)果顯示，筆者研究的家系受累患者存在BIGH3 R555W突變雜合子，突變與疾病表現(xiàn)型呈完全共分離，而在K3和K12基因沒有發(fā)現(xiàn)突變。因此，從基因突變分析結(jié)果可以確診該家系不屬于Meesmann角膜營養(yǎng)不良，而是典型的顆粒狀角膜營養(yǎng)不良。

據(jù)報道在該家系中先證者角膜病變開始發(fā)生于上皮層[3]，隨后波及角膜實質(zhì)部。因此，結(jié)合臨床癥狀與基因突變分析，該家系患者又可能是BIGH3 R555W雜合突變導(dǎo)致的角膜上皮層與基質(zhì)層先后受累的顆粒狀角膜營養(yǎng)不良，可歸于淺表變異型顆粒狀角膜營養(yǎng)不良。Escribano等研究表明角膜上皮細胞特異性高表達BIGH3基因[6];Hirano等認為BIGH3蛋白是由上皮細胞合成，內(nèi)皮細胞也可能合成BIGH3蛋白[7];Okada曾報道一種由BIGH3 R555W純合子突變導(dǎo)致的淺表變異顆粒狀角膜營養(yǎng)不良[8]。這些報道間接說明BIGH3 R555W雜合突變也又可能導(dǎo)致淺表變異型顆粒狀角膜營養(yǎng)不良。遺憾的是沒有先證者的早期裂隙燈照片及組織病理檢測來直接支持這種可能性。

參考文獻：

[1]Pieramici S F，Afshari N A. Genetics of corneal dystrophies: the evolving landscape[J]. Curr Opin Ophthalmol， 2006，17(4):361366.

[2]Irvine A D，Corden L D，Swensson O，et al. Mutations in corneaspecific keratin K3 or K12 genes cause Meesmann's corneal dystrophy[J]. Nat Genet， 1997，16:184187.

[3]肖繼勇，童繹. Meesmann角膜營養(yǎng)不良一家系[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志， 1993，10(1):9.

[4]Chen Y T，Tseng S H，Chao S C. Novel mutations in the helix termination motif of Keratin 3 and Keratin 12 in 2 Taiwanese families with Meesmann corneal dystrophy[J]. Cornea， 2005，24:928932.

[5]Munier F L，F(xiàn)rueb B E，OtheninGirard P，et al. BIGH3 mutation spectrum in corneal dystrophies[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci， 2002，43(4):949954.

[6]Escribano J，Hernando N，Ghosh S，et al. cDNA from human ocular ciliary epithelium homologous to beta igh3 is preferentially expressed as an extracellular protein in the corneal epithelium[J]. J Cell Physiol， 1994，160(3):511521.

篇6

【關(guān)鍵詞】川奇消食化積口服液；小鼠淋巴瘤細胞株；TK基因突變

【中圖分類號】TS201.6 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）07-4119-01

保健食品具有補充膳食來源、延緩衰老、美容、改善睡眠等功能，但在生產(chǎn)過程中的各種問題也日趨明顯，為更好的控制其質(zhì)量，促進健康發(fā)展，應(yīng)加強其檢驗工作。

TK基因突變試驗的檢測終點是胸苷激酶（thymidine kinase， TK）基因的突變，具有很高的靈敏度，廣泛用于檢測外來化合物的遺傳毒性[1]。該測試系統(tǒng)可檢測外來化合物引起的突變，包括堿基對突變、移碼突變和缺失等，從而評價保健食品引起突變的可能性，本文采用TK基因突變試驗評價川奇消食化積口服液的致突變性。

3 討論

川奇消食化積口服液的主要成分為山楂、雞內(nèi)金、白扁豆、茯苓，可促進消化吸收，用于消化不良者。我國對化合物（包括食品污染物、藥物、化妝品等）的常規(guī)遺傳毒性評價方法包括：①細菌試驗（Ames試驗）；②哺乳動物體細胞突變試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、染色體畸變試驗；③哺乳類生殖細胞突變試驗[2]。

本文采用TK基因突變試驗檢測川奇消食化積口服液的致突變性。tk+/-基因型細胞突變?yōu)閠k-/-基因型細胞后能拮抗三氟胸苷（TFT）而存活，據(jù)突變集落形成數(shù)，計算突變頻率，可判定受試物的致突變性[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，按1%體積比給藥，受試物原液、1/2原液、1/4原液、1/8原液四個劑量組均未產(chǎn)生細胞毒性，在活化狀態(tài)及非活化狀態(tài)下均不具有致突變性。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[S].2003.

篇7

關(guān)鍵詞：非小細胞肺癌 ELM4-ALK融合基因 EGFR突變基因

正文

肺癌是全球發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤，其中，非小細胞肺癌的傳統(tǒng)治療方法有化療，放療，手術(shù)等。隨著腫瘤發(fā)病機制研究的不斷深入，分子靶向治療已經(jīng)成為了研發(fā)熱點，并初步取得了顯著療效。EGFR，EML4-ALK等靶點的分子抑制劑在臨床上的成功讓學(xué)者們將更多的精力投入到靶向分子的研究中，2011年ASCO大會提示腫瘤診療已經(jīng)進入分子靶向治療的時代。以往大部分的研究都認為，非小細胞肺癌中EML4-ALK多數(shù)情況下與EGFR及KRAS突變是相互排斥的[1-3]. 近期陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有EML4-ALK融合基因和EGFR突變共存的案例。在強調(diào)個體化治療的時代，這部分患者其臨床表現(xiàn)有何特點？該如何治療？本文將就這些問題進行探討。

EML4-ALK融合基因的分子結(jié)構(gòu)及在NSCLC的發(fā)生率

ALK(anaplastic lymphoma kinase 間變淋巴瘤激酶)是一個由1620個氨基酸組成的跨膜蛋白，屬于胰島素受體家族[4]。

EML4(echinoderm microtubule—associated protein—like4)由 N末端堿基區(qū)、疏水的棘皮動物微管相關(guān)蛋白區(qū)以及WD重復(fù)區(qū)3 部分構(gòu)成，屬于棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣蛋白家族。

EML4-ALK融合基因是由日本學(xué)者Soda等在一名62歲有吸煙史的男性腺癌NSCLC患者的腫瘤組織中首次發(fā)現(xiàn)的?；虻闹嘏虐l(fā)生在2號染色體短臂上的2區(qū)1帶和2區(qū)3帶。ALK基因的3′端與EML4基因的5′倒位融合，EML4基因斷裂后形成不同長度的外顯子拼接片段，插入位置相對保守的ALK基因的19號、20號外顯子之間[5]，融合基因的ALK部分均為20外顯子編碼的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)片段，而EML4部分則為不同的外顯子片段，從而形成有11個變體的EML4-ALK融合蛋白[1, 2, 5-10]，融合基因大多都有致瘤性[11, 12]。

文獻報道[13]，不加選擇的NSCLC患者EML4-ALK融合基因總發(fā)生率為3.4%（范圍0.4%-11.6%）。東方人群NSCLC患者的總發(fā)生率為4.1%，歐美人群為2.5%。Shaw等[8]在女性，亞裔，不吸煙或者是輕度吸煙（每年吸煙≤10包或戒煙≥1年者）這4個條件中至少滿足2個條件的141名肺腺癌患者的腫瘤組織中用FISH法檢測了EML4-ALK融合基因的發(fā)生率，結(jié)果顯示其發(fā)生率高達13%；在EGFR和KRAS均為野生型的不吸煙/輕度吸煙者則為33%。Zhang等[3]用RACE-coupled PCR sequencing 法在中國NSCLC患者中進行檢測，結(jié)果表明在中國的非選擇性NSCLC患者中該融合基因的發(fā)生率為11.6%，EGFR和KRAS均為野生型的不吸煙/輕度吸煙者則高達42.8%。

EGFR突變基因的分子結(jié)構(gòu)及發(fā)生率

EGFR（epidermal growth factor receptor表皮生長因子受體）具有受體酪氨酸激酶活性，屬于Ⅰ型生長因子受體家族，由1個胞外配體結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和一個胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成。

EGFR基因位于7號染色體短臂的12-14區(qū)，由28個外顯子組成，突變多位于19-21外顯子（酪氨酸激酶功能區(qū)），其突變主要有3種類型：a. 19外顯子堿基缺失 改變了受體ATP結(jié)合囊（ATP-binding pocket，ABP）角度，增強了腫瘤細胞對TKI的敏感性[14, 15]。Shigermatsu等[16]發(fā)現(xiàn)外顯子19突變的發(fā)生率最高，占EGFR突變總數(shù)的50%以上；b. 20外顯子點突變或堿基插入突變 20外顯子的點突變主要是第790位密碼子出現(xiàn)C-T轉(zhuǎn)換，從而引起該處的蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼幔═790M），這一突變多見于藥物治療后的復(fù)發(fā)患者，突變后腫瘤細胞對TKI產(chǎn)生抵抗[17]，插入突變出現(xiàn)在第770-775位密碼子，插入片段為3-9個堿基，其臨床意義目前尚不清楚[16]；c. 21外顯子點突變主要是851位密碼子出現(xiàn)T-G轉(zhuǎn)換，亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔↙858R），突變提高了腫瘤細胞對TKI的敏感性。

在非選擇性NSCLC患者中，EGFR在美國的非小細胞肺癌腺癌患者中突變率約為15%[18]，在亞裔人群為30%-50%,且大部分是腺癌和支氣管肺泡癌。

EGFR-TKI、ALK-TKI抑制劑與靶向患者的療效

ALK的口服抑制劑PF-023451066（crizotinib)的I期臨床試驗（NCT00585195或A8081001）開始于2006年。2009年ASCO（American Society of Clinical Oncology）年會上報道，PF-023451066的反應(yīng)率達53％ (10／19)，疾病控制率達到79％(12／19)。鑒于良好的安全性和高有效率，F(xiàn)DA批準此藥研究直接進入Ⅲ期臨床試驗，目前，該藥的全球Ⅲ期臨床試驗正在進行中。2011年ASCO對crizotinib的I期臨床試驗結(jié)果進行了更新：入組NSCLC患者已達119例，中位PFS達到10個月（95%，8.2m~14.7m），客觀反應(yīng)率達61%（95%CI，52%~70%）。中位有效應(yīng)答時間為48wks，中位生存時間達1年的概率為81%。

EGFR的抑制劑Gefitinib和Erlotinib目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床的各線治療。IPASS研究[24]比較了一線使用EGFR-TKI與一線使用化療藥物的療效，該研究結(jié)果驗證了EGFR突變對吉非替尼治療NSCLC療效的預(yù)測作用，EGFR突變患者是吉非替尼治療最大獲益人群?；贗PASS及其他三項小型臨床試驗的研究結(jié)果，ASCO于今年4月了PCO(Provisional Clinical Opinion)，建議對晚期初治的NSCLC患者進行EGFR突變測定以決定患者是進行EGFR-TKI治療還是進行化療[25]。

EML4-ALK與EGFR臨床特征及異同

EML4-ALK融合基因型患者與EGFR基因突變型患者有相似的臨床特征[8, 19]，多見于不/輕度吸煙的腺癌患者，但EML4-ALK融合基因型患者多為年輕的男性患者，且不能從EGFR TKI治療中獲益[8]。

以往的文獻多認為EML4-ALK融合型基因與EGFR基因突變是互為獨立的分子事件[1, 5, 8, 20, 21]，EML4-ALK融合型基因可能是繼KRAS之后的EGFR對TKI耐藥的另外一個原因[8]。但目前已報道有4例[3, 5, 22, 23]EML4-ALK融合型基因與EGFR基因突變共存型患者。#p#分頁標題#e#

臺灣大學(xué)附屬醫(yī)院的Kuo等[22]報道了一例EML4-ALK融合型基因與EGFR基因突變共存對EGFR TKI治療有效的患者：72歲亞裔女性腺癌（Ⅳ期 腦，骨轉(zhuǎn)移）不吸煙初治患者，經(jīng)RT-PCR和DNA測序證實的EML4-ALK融合基因（亞型1）與EGFR突變（19外顯子缺失突變 delE746-A750）共存。經(jīng)過92天的吉非替尼治療之后，CT顯示右上肺的腫物顯著性縮小，CEA從442.1ng/ml降至87.6ng/ml。

Tiseo等[23]報道了一例48歲的不吸煙高加索男性腺鱗癌患者（大部分的鱗癌混合>10%的局限性低分化腺癌），cT1N0M1(左側(cè)第10肋)，順鉑+吉西他濱治療了6周期后PET評估肺部病灶PR，肋骨轉(zhuǎn)移灶CR。之后患者行右上肺葉，淋巴結(jié)，肋骨切除術(shù)。肺部的主要病灶為EGFR 19外顯子缺失突變，KRAS野生型，ALK野生型。轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)病灶有EML4-ALK融合基因（經(jīng)FISH驗證）。3個月后患者復(fù)發(fā)，接受Erlotinib 150mg/天（兩個月）治療，無臨床受益，最終死于疾病進展。

展望

EML4-ALK融合基因是當(dāng)前研究的熱點，其已成為NSCLC的一個亞型，PF-023451066（crizotinib)的Ⅲ期臨床試驗正在進行，Crizotinib能否像EGFR TKI一樣成為NSCLC治療上的一個里程碑，讓我們拭目以待。EGFR TKI目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床的治療，在治療晚期EGFR突變的NSCLC患者中療效顯著。但對于EML4-ALK融合基因與EGFR基因突變共存型患者，目前的研究和報道還很少，仍有許多問題值得思考和研究：EML4-ALK融合基因與EGFR突變基因究竟是同時存在于同一個腫瘤組織中還是分別存在于一個腫塊之中？共存型患者其EML4-ALK與EGFR的下游的分子生物學(xué)行為如何？兩個案例報道中患者對EGFR TKI的反應(yīng)恰好相反，是否因為EML4-ALK不同亞型對EGFR TKI的敏感性不同？對于共存型患者該如何應(yīng)用TKI？多靶點抑制劑會不會是共存型患者的更好選擇？期待有深入的實驗研究和臨床研究來解決這些問題，使患者以最小的花費取得最佳療效，真正在基因水平上實現(xiàn)肺癌的個性化治療。

參考文獻

[1] Soda M, Choi Y L, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer[J]. Nature,2007,448(7153):561-566.

[2] Inamura K, Takeuchi K, Togashi Y, et al. EML4-ALK fusion is linked to histological characteristics in a subset of lung cancers[J]. J Thorac Oncol,2008,3(1):13-17.

[3] Zhang X, Zhang S, Yang X, et al. Fusion of EML4 and ALK is associated with development of lung adenocarcinomas lacking EGFR and KRAS mutations and is correlated with ALK expression[J]. Mol Cancer,2010,9:188.

[4] Morris S W, Naeve C, Mathew P, et al. ALK, the chromosome 2 gene locus altered by the t(2;5) in non-Hodgkin's lymphoma, encodes a novel neural receptor tyrosine kinase that is highly related to leukocyte tyrosine kinase (LTK)[J]. Oncogene,1997,14(18):2175-2188.

[5] Koivunen J P, Mermel C, Zejnullahu K, et al. EML4-ALK fusion gene and efficacy of an ALK kinase inhibitor in lung cancer[J]. Clin Cancer Res,2008,14(13):4275-4283.

[6] Inamura K, Takeuchi K, Togashi Y, et al. EML4-ALK lung cancers are characterized by rare other mutations, a TTF-1 cell lineage, an acinar histology, and young onset[J]. Mod Pathol,2009,22(4):508-515.

[7] Martelli M P, Sozzi G, Hernandez L, et al. EML4-ALK rearrangement in non-small cell lung cancer and non-tumor lung tissues[J]. Am J Pathol,2009,174(2):661-670.

篇8

【摘要】

目的 應(yīng)用變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)異源雙鏈分析對鼻咽癌患者XRCC4基因突變進行篩查與鑒定，研究鼻咽癌患者XRCC4的基因突變情況，探討DHPLC在篩查相關(guān)基因突變、預(yù)測放療敏感性方面的應(yīng)用。 方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DHPLC篩查88例鼻咽癌患者XRCC4基因的突變。 結(jié)果 對DHPLC圖形異常的PCR擴增片斷進行DNA測序鑒定突變位點及性質(zhì)，檢測出28例XRCC4基因8號外顯子第377位C變成T，導(dǎo)致126號密碼子的serphe，導(dǎo)致氨基酸殘基的替代變化(絲氨酸苯丙氨酸)。 結(jié)論 用PCRDHPLC篩查結(jié)合測序分析檢測XRCC4突變是一種高效、經(jīng)濟、簡便、可靠的方法。

【關(guān)鍵詞】 鼻咽腫瘤 輻射耐受性 突變 腫瘤細胞 培養(yǎng)的 DNA修復(fù) 色譜法 高壓液相 基因型

DNA分子是惡性腫瘤放療輻射作用的靶點，細胞對電離輻射反應(yīng)的分子基礎(chǔ)是DNA損傷[1]。DNA雙鏈斷裂是放射治療過程中的主要損傷形式，而細胞內(nèi)產(chǎn)生的DSBs可以通過同源重組和非同源末端連接兩種途徑進行修復(fù)。未修復(fù)的DSBs損傷將導(dǎo)致細胞死亡。近年來的研究表明，DNA修復(fù)基因突變、單核苷酸多態(tài)性均可改變DNA的修復(fù)能力。因此檢測DNA修復(fù)基因的分子狀態(tài)可能成為個體腫瘤放療敏感性的預(yù)測指標。XRCC4是DNA損傷修復(fù)的主要基因之一，缺乏XRCC4的細胞特別容易受到離子輻射的傷害。XRCC4基因的突變可能影響腫瘤細胞的DNA損傷修復(fù)能力，進而影響其對輻射的敏感性以及放射治療的療效。因此，XRCC4基因的突變檢測可為其與腫瘤放射敏感性關(guān)系的研究以及探討作為腫瘤個體放療敏感性的預(yù)測指標的可行性提供研究基礎(chǔ)。

變性高效液相色譜(denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC)是一種高通量篩選基因組DNA序列變異的新手段。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和DHPLC異源雙鏈分析與DNA測序等方法對88例鼻咽癌患者進行XRCC4基因突變篩查與鑒定，探討DHPLC檢測該基因突變的適宜條件，為DHPLC技術(shù)在篩查相關(guān)基因突變，預(yù)測放療敏感性的應(yīng)用方面提供研究基礎(chǔ)。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2002年9月-2003年9月福建省腫瘤醫(yī)院放療科經(jīng)病理確診、初治的鼻咽癌患者88例，男性67例，年齡(48±12.71)歲(21～76歲);女性21例，年齡(48±11.15)歲(26～69歲)。治療前經(jīng)鼻咽鏡取鼻咽活檢組織。DNA抽提試劑盒(德國Qiagen公司);Taq DNA聚合酶(金牌酶，瑞士Roche公司);基因擴增儀(PTC200，美國BIORAD DNA ENGINE公司);DHPLC(4500WAVE，美國Transgenomic公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA抽提 用組織DNA抽提試劑盒抽提患者鼻咽部癌組織基因組DNA，核酸蛋白檢測儀定量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR引物設(shè)計與合成 人類XRCC4基因有8個外顯子，因為此基因突變多發(fā)生于其1號、4號、7號和8號外顯子，其中第8外顯子較長，需分成2個相互重疊的片段進行擴增，故選擇這4個外顯子設(shè)計5對引物。引物由上海博鴻生物公司合成。引物序列如下：片段名引物名引 物 序 列Exon1R

FCCGGAAAAGGCGGGATTTAG

GGGGATTCTCGCATTGTGGAExon4R

FGTGTATGCTTAAAACCAGGC

AACAACATAAAGAGGGCTCCExon7R

FTCAATGCTAAAACAGCAAGT

GATTCAAACATTTTACAATTCCExon81R

FCTTTTACTCTATAACAGAAGTT

ATAGTTTAGAATAATGTGCCExon82R

FGTGAATTGAAACCATTGTGC

GGTTACATTTACATTAATAAGCAGT

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及條件 PCR反應(yīng)體系50 μL，含0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+，DNA模板100 ng，Taq DNA聚合酶1.25 U，上下游引物各0.2 μmol/L。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性10 min94 ℃ 40 s54 ℃～64 ℃ 45 s 72 ℃ 35 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖(含溴化乙錠0.5 μg/mL)凝膠電泳檢測。

1.2.4 DHPLC篩選XRCC4突變 對有效擴增的PCR 產(chǎn)物行DHPLC篩查突變，檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物，其分離柱固相為烷基化C18，中間橋分子為TEAA，洗脫緩沖液主要成分為乙腈。標本上機之前通過軟件分析序列的理論溫度分離曲線，摸索出最佳的分離溫度后進行突變篩選分析。

1.2.5 DNA測序 根據(jù)DHPLC系統(tǒng)檢測結(jié)果，將不同峰型的PCR產(chǎn)物送日本TAKARA公司進行DNA序列測定。

2 結(jié) 果

2.1 DHPLC篩查結(jié)果 每份樣本均檢測上述5個片段的PCR產(chǎn)物，每份樣品在50 ℃的非變性溫度下均為對稱性單峰;在部分變性的溫度下，1號、4號、7號和8號外顯子的81片斷均為單個色譜峰，只有8號外顯子的82片斷的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)雜合峰與純合峰兩種情況，單個色譜峰顯示為純合鏈，雙峰或三峰表示是雜合異源雙鏈。出現(xiàn)雜合峰顯示有突變的異源雙鏈存在。不同樣品的PCR產(chǎn)物的8號外顯子82段在同一DHPLC運行條件下突變峰形基本相同(代表峰形見圖1)，提示8號外顯子的82段具有單一類型的突變。

2.2 DNA測序結(jié)果 選擇DHPLC檢測為雜合峰與單個峰的標本測序，測序結(jié)果顯示28例患者的XRCC4基因第8號外顯子第377位堿基C變成T(圖2)。

3 討 論

DHPLC異源雙鏈分析法是近年來才發(fā)展起來的一項新的基因突變高通量篩查技術(shù)。與其他相關(guān)技術(shù)相比，DHPLC的DNA分離柱具有很好的溫度穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，具有很長的有效壽命(>6 000次進樣)和極好的分析穩(wěn)定性(99%)。DHPLC異源雙鏈分析法解決了RFLP技術(shù)受酶切位點和酶切條件的限制、擴大了檢測范圍、提高了檢測的準確性、又解決了SSCP技術(shù)耗時耗力的缺點，實現(xiàn)了樣品的自動化檢測;同時檢測的靈敏度、重復(fù)性和檢測的通量也得到大提高，從而在基因篩查工作中具有更廣泛的應(yīng)用范圍[2]。已有學(xué)者進行了DHPLC相關(guān)的方法學(xué)比較研究，均提示其敏感性和特異性可達96%～100%[3]，明顯高于常用的變性梯度凝膠電泳、構(gòu)象敏感性凝膠電泳、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析等變異檢測技術(shù)。DHPLC突變檢測技術(shù)與其它方法相比，具有更高的準確性和敏感性[45]。

本組資料應(yīng)用DHPLC分析鼻咽癌組織XRCC4的突變，探討DHPLC檢測該基因突變的適宜條件。由于PCR產(chǎn)物中雜帶的存在會導(dǎo)致目的峰周圍出現(xiàn)干擾峰，這些干擾峰往往會誤判為突變峰形，應(yīng)用DHPLC分析時筆者通過以下幾種方法來排除干擾峰：(1)通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件防止雜帶產(chǎn)生;(2)通過比較部分變性溫度和非變性溫度下的峰形來排除干擾峰，凡是在部分變性溫度下呈現(xiàn)的雙峰或多峰在50 ℃的非變性溫度下同樣表現(xiàn)出來，則提示有干擾峰的存在;(3)通過保留時間來判斷有無干擾峰存在，因為突變引起的雙峰或多峰的保留時間應(yīng)相差不大。

本研究通過PCRDHPLC篩查，共檢測了88例患者XRCC4基因各5個片段的PCR產(chǎn)物，在部分變性的溫度下，28例患者的8號外顯子82所擴增的片段中出現(xiàn)雜合峰與純合峰兩種情況，經(jīng)DNA測序分析證實單個色譜峰樣本未測出突變，雙峰或三峰樣本檢測出突變，即8號外顯子第377位堿基C變成T，此外，不同樣品的PCR產(chǎn)物的8號外顯子在同一DHPLC運行條件下突變峰形基本相同，提示8號外顯子具有單一類型的突變。該變異導(dǎo)致126號密碼子的serphe，致使氨基酸殘基發(fā)生替代變化(絲氨酸苯丙氨酸)，這一替代對改變DNA修復(fù)能力的作用以及是否影響鼻咽癌細胞DNA損傷修復(fù)能力和放射治療療效，還有待于進一步的研究探討。

參考文獻

[1] Shrivastav M， De Haro L P. Regulation of DNA doublestrand break repair pathway choice[J]. Cell Res， 2008，18(1):134147.

[2] Yeh H M， Tsai M C，Su Y N，et al. Denaturing high performance liquid chromatography screening of ryanodine receptor type 1 gene in patients with malignant hyperthermia in Taiwan and identification of a novel mutation (Y522C)[J]. Anesth Analg， 2005，101(5):14011406.

[3] Fackenthal D L， Chen P X， Das S. Denaturing highperformance liquid chromatography for mutation detection and genotyping[J]. Methods Mol Biol， 2005，3110(5):7396.

篇9

【摘要】 目的 探討急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia， AML)患者人Fms樣酪氨酸激酶3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(Fmslike tyrosine kinase3intenal tandem duplication， FLT3ITD)基因突變及其臨床意義。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)變性高效液相色譜(polymerase chain reactiondenaturing high performance liquid chromatography， PCRDHPLC)方法檢測60例初治AML患者和10例對照組骨髓FLT3ITD基因突變。結(jié)果 60例AML患者FLT3ITD突變陽性率21.67%(13/60)，10例對照組均未檢測到該突變;FAB各亞型FLT3ITD突變率不同，有M3型突變率較高的趨勢;FLT3ITD陽性組外周血白細胞數(shù)、骨髓白血病細胞比例高于FLT3ITD陰性組(P

【關(guān)鍵詞】 急性髓細胞白血病;FLT3;內(nèi)部串聯(lián)重復(fù);基因;聚合酶鏈反應(yīng)變性高效液相色譜技術(shù)

ABSTRACT: Objective To investigate the mutation of FLT3 internal tandem duplication (ITD) in patients with acute myeloid leukemia (AML) and its clinical significance. Methods The mutation of FLT3ITD in bone marrow samples from 60 patients with de novo AML and 10 control groups was detected by polymerase chain reaction denaturinghigh performance liquid chromatography (PCRDHPLC). Results There were 13 out of 60 (21.67%) AML patients identified with FLT3ITD mutation， which was not identified in 10 of the control groups. Different FAB subtypes of AML had different mutation rate， and M3 had an obviously higher mutation rate than other subtypes. The peripheral white cell count and bone marrow blast cells were significantly higher in patients with FLT3ITD mutation than in those without (P

KEY WORDS: acute myeloid leukemia; FLT3; internal tandem duplication; gene; polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography

人FLT3是Ⅲ型酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase， RTK)家族成員的原癌基因，其蛋白產(chǎn)物屬于受體，定位于細胞膜上。在正常人骨髓中，F(xiàn)LT3的表達僅限于CD34+干/祖細胞，該受體與多種胞漿蛋白作用介導(dǎo)一系列細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)細胞增殖和分化。近來研究發(fā)現(xiàn)FLT3基因的異常表達、突變與急性白血病(acute leukemia， AL)的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有密切關(guān)系[13]。酪氨酸激酶受體基因FLT3的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列(FLT3 internal tandem duplications， FLT3ITD)是一種FLT3的近膜區(qū)的突變，由NAKAO等[4]研究急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia， AML)時，于1996年首先報道。為探討AML患者FLT3ITD的突變情況，我們采用聚合酶鏈反應(yīng)變性高效液相色譜(polymerase chain reactiondenaturing high performance liquid chroma

tography， PCRDHPLC)技術(shù)檢測60例初治AML患者骨髓FLT3ITD的突變情況并分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 60例初治AML患者，診斷及療效標準參照《血液病診斷及療效標準》[5]。男27例，女33例，中位年齡48歲(18～79歲)。FAB分型為M0 3例，M1 3例，M2 14例，M3 13例，M4 13例，M5 12例，M6 2例，M7 0例。老年AML 30例(年齡>60歲)，非老年AML 30例，正常人及良性血液病患者為對照組共10例(3例健康人，5例缺鐵性貧血患者，2例特發(fā)性血小板減少性紫癜患者)。

1.2 實驗方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)變性高效液相色譜(PCRDHPLC)方法。①DNA制備。取患者骨髓液2mL，應(yīng)用美國Promega公司DNA提取試劑盒抽提總DNA。測定吸光度A260nm/A280nm值，確定DNA的純度及濃度，并以去離子水稀釋DNA樣本為1g/L。②PCR擴增。應(yīng)用Primer Express V2.0軟件包以13號染色體外顯子14、15設(shè)計引物，包括整個近膜區(qū)(JM)和激酶結(jié)構(gòu)起始部分，擴增產(chǎn)物為329bp。引物由上海捷瑞公司合成，正義引物：5′GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC3′;反義引物：5′CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC3′。PCR反應(yīng)體系(50μL)：10×PCR緩沖液5μL，25mmol/L MgCl2 6μL，10mmol/L dNTP 1μL，10μmol/L正/反義引物各2μL，模板DNA 4μL，Taq DNA酶0.5μL，雙蒸水29.5μL。PCR條件：94℃，5min，1個循環(huán);94℃，45s，56℃，45s，72℃，45s，共循環(huán)35次;72℃延伸10min，1個循環(huán)。③測序分析。部分變性DHPLC分析突變陽性產(chǎn)物：5μL預(yù)處理的PCR產(chǎn)物上樣于Transgenomic公司的DNA sep分離柱，然后觀察DHPLC圖譜形態(tài)。發(fā)現(xiàn)異常的圖譜形態(tài)PCR產(chǎn)物，純化后測序(由大連寶生物生物公司幫助完成)，分析各FLT3ITD序列。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料在作t檢驗、方差分析前先進行正態(tài)性、方差齊性檢驗，單變量兩組資料采用t檢驗，方差不齊者采用非參數(shù)檢驗;計數(shù)資料采用卡方檢驗，P

2 結(jié) 果

2.1 AML患者FLT3/ITD基因突變的檢測 60例初發(fā)AML患者，13例FLT3ITD突變陽性患者(21.67%)，其中M2 21.4%(3/14)，M3 30.8%(4/13)，M4 23.1%(3/13)，M5 25.0%(3/12)，M0、M1、M6、M7均未檢測到該突變，有M3型突變率較高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。本實驗檢測的突變均為雜和突變，各例突變區(qū)域大小不等(6～100bp)，均為框內(nèi)突變。10例對照組均未檢測到突變。

2.2 FLT3ITD陽性AML患者臨床特征 60例初治AML組中，13例FLT3ITD突變陽性，其中女8例(占25.0%)，男5例(占17.9%)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);30例老年AML組，8例 FLT3ITD突變陽性，突變陽性率26.7%，30例非老年AML組，5例FLT3ITD突變陽性，突變陽性率16.7%，二者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

2.3 FLT3ITD陽性AML患者的療效 采用DA(柔紅霉素、阿糖胞苷)或HA(高三尖杉酯堿、阿糖胞苷)方案治療;M3首選維甲酸;13例FLT3ITD陽性AML患者6例獲得CR(46.2%)，47例FLT3ITD陰性AML患者34例獲得CR(72.3%)，二者相比差異有顯著性(P

3 討 論

FLT3ITD突變是近年來AML中最常見的突變類型之一。正常情況下，酪氨酸激酶磷酸化作用是由酪氨酸激酶和酪氨酸激酶拮抗調(diào)節(jié)維持平衡的。如發(fā)生基因突變，將導(dǎo)致酪氨酸激酶持續(xù)活化，進而阻斷對細胞的分化、增殖和凋亡調(diào)節(jié)功能，與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系。有研究表明[67]，約有19.2%～32.0%的AML患者存在有FLT3ITD突變，在成人新發(fā)AML的陽性率22.9%，在老年AML的陽性率為31.4%，在FAB亞型中，F(xiàn)LT3/ITD突變在M3的陽性率最高，M5次之，M2、M6的陽性率較低。我們檢測的結(jié)果顯示，在AML中FLT3ITD突變陽性率為21.67%，其中M3最高，M5次之。說明FLT3ITD突變在AML患者的疾病發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，也提示FLT3ITD對于M3可能是一個預(yù)后不良的指標。

從臨床資料分析，F(xiàn)LT3ITD有它獨特的臨床表現(xiàn)，男女無統(tǒng)計學(xué)意義;老年AML患者FLT3ITD突變陽性率高于非老年，二者有顯著性差異，提示FLT3ITD突變可能與年齡有關(guān)，與老年AML的發(fā)生及預(yù)后存在密切關(guān)系，這與國內(nèi)外報道相似[78]。我們的結(jié)果還顯示，F(xiàn)LT3ITD突變陽性者具有外周血白細胞數(shù)高、骨髓白血病細胞比例多的臨床特點，這與YANADA等[9]報道相似。我們的結(jié)果顯示，F(xiàn)LT3ITD陽性AML患者CR率較FLT3ITD陰性AML患者低，二者有顯著性差異。一方面說明FLT3ITD陽性AML患者對化療不敏感，有抗藥性，這與BANG等[10]報道一致，另一方面說明FLT3ITD陽性AML患者預(yù)后差。有作者對FLT3ITD重復(fù)序列的長度與預(yù)后的關(guān)系進行了研究，認為較長的重復(fù)序列與不良預(yù)后相關(guān)[11]，我們的結(jié)果顯示，F(xiàn)LT3ITD陽性AML患者CR率較FLT3ITD陰性AML患者低，二者有顯著性差異，F(xiàn)LT3ITD陽性AML患者外周血白細胞數(shù)、骨髓白血病細胞比例高于FLT3ITD陰性AML患者，這兩個指標均提示預(yù)后差，說明FLT3ITD基因突變可作為預(yù)測AML預(yù)后的一個指標。

參考文獻

[1]STIREWALT DI， RADICH JP. The role of FLT3 in haematopoietic malignancies [J]. Nat Rev Cancer， 2003， 3(9):650665.

[2]PENG HL， ZHANG GS， GONG FJ， et al. Fmslike tyrosine kinase (FLT)3 and FLT3 Internal tandem duplication in different types of adult leukemia: analysis of 147 patients [J]. Croat Med， 2008， 49(5):650659.

[3]王云貴，劉旭輝，梁毅，等. FLT3基因表達水平及內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)突變與急性髓系白血病的關(guān)系及臨床意義 [J]. 中華血液學(xué)雜志， 2008， 29(11):741745.

[4]NAKAO M， YOKOTA S， IWAI T， et al. Internal tandem duplication of the flt3 gene found in acute myeloid leukemia [J]. Leukemia， 1996， 10(12):19111918.

[5]張之南，沈悌. 血液病診斷及療效標準 [M]. 第2版. 北京：科學(xué)出版社， 1998:168193.

[6]SMALL D. FLT3 Mutations: biology and treatment hematology [J]. Am Soc Hematol Educ Program， 2006:178184.

[7]徐兵，林榕，周淑蕓. 老年人急性髓系白血病FLT3/ITD基因突變的檢測及臨床意義 [J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志， 2003， 19(12):13101311.

[8]STIREWALT DL， KOPECKY KJ， MESHINCHI S， et al. FLT3， RAS and P53 mutations in elderly patients with acute myeloid leukemia [J]. Blood， 2001， 97(11):35893594.

[9]YANADA M， MATSUO K， SUZUKI T， et al. Prognostic significance of FLT3 internal tandem duplication and tyrosine kinase domain mutations for acute myeloid leukemia: A metaanalysis [J]. Leukemia， 2005， 19(8):13451349.

篇10

關(guān)鍵詞：遺傳性對稱性色素異常癥；ADAR基因；基因編碼區(qū)

Abstract：Objective To detect the ADAR mutant gene in the family of hereditary symmetry pigment abnormalities.Methods clinical data of patients with peripheral blood DNA extraction，all PCR amplification of ADAR gene encoding region of exon and flanking sequences，PCR products were purified and directly sequenced，and compared with the genomic sequence，find no mutation.Results No mutations were found in all the exons and flanking sequences of the candidate gene coding region.Conclusion The ADAR gene coding region is not related to the pathogenesis of hereditary symmetry pigment abnormalities in this study.

Key words：Hereditary symmetry pigment abnormalities；ADAR gene；Gene coding region

遺傳性對稱性色素異常癥（Dyschromatosis symmetrica hereditaria，DSH）是一種少見的常染色體顯性遺傳性皮膚病。主要表現(xiàn)為散在分布于手足背的對稱性色素沉著及色素減退斑，少數(shù)伴有面部雀斑樣損害，可延及四肢及全身[1]。2003年張學(xué)軍等[2]將該病的致病基因定位于1q11～1q21區(qū)域。Miyamura等[3]將該病的致病基因確定為ADAR基因。我們收集到1個DSH家系，利用PCR和直接測序方法進行突變檢測，以期發(fā)現(xiàn)在該家系中是否存在ADAR基因突變。

1資料與方法

1.1一般資料 先證者：女，6歲。雙手足背出現(xiàn)色素異常4年，皮疹漸加重，無不適。系統(tǒng)查體：未見明顯異常。皮膚科檢查：雙手足背可見米粒至黃豆大小褐素沉著斑，夾雜色素減退斑，見圖2、圖4。面部散在粟粒至黃豆大小色素沉著斑，見圖1。父母非近親結(jié)婚。家系調(diào)查：先證者父親，31歲，自3歲起雙手足背、面部出現(xiàn)與先證者相似皮損，見圖3、圖5、見圖6。亦呈夏重冬輕現(xiàn)象。無其他自覺癥狀。系統(tǒng)查體：未見明顯異常。皮膚科檢查：雙手足背可見米粒至黃豆大小褐素沉著斑，夾雜色素減退斑。面部散在粟粒至黃豆大小色素沉著斑。家系圖，見圖7。組織病理檢查：（先證者父親右足背色素斑） 表皮輕度角化過度，表皮基底細胞灶性黑素減少與增加交替分布，真皮淺層血管周圍少許淋巴細胞浸潤，見圖8、圖9。診斷：遺傳性對稱性色素異常癥。

1.2材料與方法

1.2.1 外周血基因組DNA提取。

1.2.2 PCR擴增及DNA測序ADAR基因，見表1。

ABI PRISM 3730XL自動測序儀直接測序。測序結(jié)果利用Sequeneher 4.10.1Demo軟件與基因組標準序列進行比對分析。

2結(jié)果

2.1 基因突變檢測

2.1. 擴增DSRAD基因的15個外顯子編碼區(qū)及側(cè)翼序列，經(jīng)過http：//ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/進行反復(fù)仔細比對，未發(fā)現(xiàn)任何致病突變。

3討論

遺傳性對稱性色素異常癥（DSH ）， 系常染色體顯性遺傳病，最先由Toyam a于1910年描述， 并于1929年正式命名。嬰兒期或兒童期發(fā)病。張學(xué)軍等首次將本病定位在1q11-1q21區(qū)間內(nèi)， 該區(qū)間內(nèi)的雙鏈RNA 特異性腺苷脫氨酶基因（ADAR） 被證實是本病的致病基因。迄今已超過140種不同的ADAR基因的突變報道，其中約60%的突變點位于編碼ADEAMc區(qū)的堿基序列上，因此有筆者認為ADEAMc區(qū)是該病基因的突變熱點區(qū)域。本家系2位患者ADAR基因的15個外顯子編碼區(qū)及側(cè)翼序列進行測序未發(fā)現(xiàn)任何致病突變。劉紅等曾對8個DSH家系進行ADAR的直接測序，其中的2個家系也未發(fā)現(xiàn)任何突變，分析原因可能位于內(nèi)含子區(qū)域、5'端啟動子區(qū)域?？紤]到遺傳異質(zhì)性，原因還可能是致病基因ADAR之外的其它基因。至今中國人遺傳性對稱性色素異常癥的分子遺傳學(xué)研究報道中尚未發(fā)現(xiàn)除ADAR基因編碼區(qū)以外的突變位點。因此定位漢族人群中該病的易感基因或篩查已知易感基因的突變類型仍是該病的一個研究方向。本家系致病基因的定位研究，仍在進行中。

參考文獻：

[1]趙辨.中國臨床皮膚病學(xué)[M].第1版.南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2010.1479.