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【摘要】研究自制的兔耳廓脫細胞軟骨基質(zhì)（extracellularcartilagematrix，ecm）修復(fù)骨缺損的特點及機理。［方法］采用新西蘭大白兔共40只，隨機分A、B兩組，在其兩側(cè)橈骨干中段制作5mm的骨缺損模型。右側(cè)作為實驗側(cè)，缺損區(qū)A組植入脫細胞軟骨基質(zhì)復(fù)合自體培養(yǎng)骨髓干細胞，B組僅植入脫細胞軟骨基質(zhì)，左側(cè)為空白對照。分別于2、4、6、10周處死動物，標(biāo)本行放射學(xué)及組織學(xué)檢查。［結(jié)果］X線及組織切片均證實復(fù)合體在6周時已有致密骨組織形成，10周時已有新生髓腔生成。［結(jié)論］表明兔耳廓脫細胞軟骨基質(zhì)與自體骨髓干細胞復(fù)合體有良好的成骨能力，有引導(dǎo)組織再生、防止骨不連作用。

【關(guān)鍵詞】骨缺損骨移植脫細胞軟骨基質(zhì)軟骨細胞

Abstract：［Objective］Thecharacteristicsandmechanismofthebonedefectrepairwiththeusingallogenicextracellularcartilagematrix（ECM）werestudied.［Method］FortyNewZealandwhiterubbitsweredividedintothreegroupsatrandom:AandBontherightside,thedefectwascoveredwiththecomplexofECMandautologousmesenchymalstemcells（MSCs）,theECMinthegroupsAandB,respectively.Thedefectsontheleftsideservedascontrolscorrespondingly.Therabbitswerekilledatthe2nd,4th,6th,10thweek.Samplesweretakenforradiologicalandhistologicalstudies.［Result］Intheexperimentalsidesthebonedefectswerehealed.Newboneappearedinthewayofintramembranousossificationandentochondrostosis.［Conclusion］ItissuggestedthatthecomplexofECMandautologousMSCshastheeffectsonguidingboneregenerationandpreventingfromnonunion.

Keywords:bonedefect;bonegrafting;extracellularcartilagematrix（ECM）;chondrocyte

臨床上長段骨缺損造成的骨不連較常見。骨缺損的修復(fù)材料很多，自體骨移植修復(fù)效果雖理想，但其來源有限。如何選擇一種材料來提高骨缺損修復(fù)效果，這是人們正在研究的重點。作者采用經(jīng)膠原酶-去垢劑處理，去除抗原性成分的兔耳廓軟骨復(fù)合自體軟骨細胞植入兔橈骨干缺損，分別于2、4、6、10周觀察骨的修復(fù)能力。具體報告如下。

1材料和方法

1.1材料

新西蘭大白兔（購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物試驗中心），共40只，均為雄性，月齡為2~3個月，體重2.0~2.5kg。

1.2兔耳廓ECM的制備

切取2月齡兔的雙側(cè)耳廓，去除皮膚及軟骨膜，新鮮軟骨用PBS液沖洗3遍，采用去垢劑酶四步法〔1〕對軟骨進行脫細胞處理：（1）將新鮮軟骨置入Tris低滲緩沖液中，緩沖液中含有蛋白酶阻斷劑，4℃恒溫震蕩48h；（2）1％TritonX100、Tris緩沖劑抽提48h后，以蒸餾水連續(xù)沖洗24h；（3）DNaseⅠ和RNaseⅠ混合后，在37℃下消化2~4h：（4）再次用1％TritonX100、Tris緩沖劑抽提48h，取出后所有標(biāo)本用DHanks生理鹽溶液4℃下徹底清洗24~48h。完成了對軟骨脫細胞處理后，置于無菌PBS液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3骨髓干細胞的分離和培養(yǎng)

按Kadiyala等〔2〕描繪的方法，取健康2個月齡新西蘭大白兔，氯胺酮和異丙嗪肌注麻醉，雙側(cè)髂部剪毛后碘伏消毒，在無菌條件下用16號骨穿刺針在髂骨翼外側(cè)穿入骨髓腔，注射器針管內(nèi)預(yù)先含有0.1ml肝素鈉生理鹽水，抽吸骨髓液6ml移入Mc5A培養(yǎng)液5ml的離心管內(nèi)混勻，1500r／min離心5min，棄上層脂肪和上清。加入適量無血清培養(yǎng)液懸浮細胞，緩慢移入盛有比重為1.077淋巴細胞分離液的離心管中（細胞培養(yǎng)液與細胞分離液之比1∶1），以2000r／min離心20min，小心吸取界面的有核細胞乳白層，加入Mc5A培養(yǎng)液10ml，制成細胞懸液移入25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃5％CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察呈形態(tài)一致的均質(zhì)的分布均勻的細胞，可用于MSCs收集和移植〔4、5〕，計數(shù)每瓶中含有細胞1.5×105個／ml時，收集的骨髓MSCs低溫存儲中。

1.4動物模型的制備

2~3個月齡的新西蘭大白兔40只，均為雄性，體重2.0~2.5kg，隨機分為2組，每組20只，在其雙側(cè)橈骨中段，咬去5mm橈骨造成骨缺損模型，右側(cè)作為實驗側(cè)，左側(cè)為空白對照，A組中右側(cè)缺損區(qū)植入脫細胞軟骨基質(zhì)復(fù)合自體培養(yǎng)軟骨細胞，B組僅植入脫細胞軟骨基質(zhì)，分別于2、4、6、10周處死動物，標(biāo)本行放射學(xué)及組織學(xué)檢查。

1.5放射學(xué)檢查

術(shù)后第4、6、10周分別于同樣條件下拍X線片觀察骨缺損修復(fù)情況。因為ECM不顯影，如果出現(xiàn)密度增高影即表示有新骨形成。對12周的X線片根據(jù)骨缺損內(nèi)生骨面積行X線等級療效評估〔3〕。100％為5分，75%~99％為4分，50%~74％為3分，25％~49％為2分，1%~24％為1分，0為0分。

1.6組織學(xué)觀察

分別于第2、4、6、10周各處死動物，取雙側(cè)修復(fù)的，將尺橈骨分離，福爾馬林固定1周，爾后分離出橈骨，以原缺損區(qū)為中心切取橈骨10mm，作為組織學(xué)切片檢查，HE染色。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用x-±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1放射學(xué)檢查

A組實驗側(cè)（復(fù)合體側(cè)）：第4周時出現(xiàn)點狀陰影，部分出現(xiàn)毛玻璃陰影；6周時陰影密度增大，有大片鈣化，骨量增加；10周已完全骨性連接，大部分出現(xiàn)不規(guī)則骨髓腔，可見少量骨髓腔相通（圖1、2）。B組實驗側(cè)（ECM植入側(cè)）：4周后未見明顯鈣化影；6周時亦見少部分骨連接，鈣化影增寬；10周時骨缺損處有較多的鈣化，骨量增加，均都部分骨性連接，一部分出現(xiàn)不規(guī)則髓腔（圖3、4）。C對照組10周時缺損區(qū)仍無新骨形成（圖5、6）（表1）。表1兔橈骨干骨缺損治療10周時X線片療效評分結(jié)果A組實驗側(cè)（復(fù)合體側(cè)）：術(shù)后2周可見編織骨和成團的軟骨細胞，炎性細胞較少，并可見絲團狀的纖維蛋白以及增生的小動脈，有纖維骨痂形成，新的骨小梁開始出現(xiàn)；4周時編織骨量增加明顯，呈灶狀；6周時出現(xiàn)大量新生致密的骨組織，編織骨逐漸吸收降解，極少數(shù)軟骨細胞與纖維組織充填骨缺損區(qū)、10周時形成皮質(zhì)骨和成熟骨髓，伴隨骨痂生長，可見骨髓腔相通（圖7）。B組實驗側(cè)（ECM植入側(cè)）：2周時有較多軟骨細胞及纖維組織及少量炎性細胞；4周時出現(xiàn)少量新生骨，未見髓腔出現(xiàn)；6、10周時出現(xiàn)交織骨，有少許不規(guī)則髓腔，但仍見軟骨細胞（圖8）。C組對照組10周后大部分仍可見有缺損，少量地填充肉芽組織（圖9）。

2.3骨小梁形態(tài)計量分析

A組實驗側(cè)（復(fù)合體側(cè)）新生骨小梁面積（17.43±4.58）mm2，高于B組實驗側(cè)（ECM植入側(cè)）新生骨小梁面積（11.92±3.19）mm2，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.59，P＜0.05）；而A組實驗側(cè)和B組實驗側(cè)與C組對照側(cè)（8.25±5.33）的新生骨小梁面積相比較具有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.68，P＜0.001；t=9.56，P＜0.05）。

3討論

3.1概述

骨缺損的修復(fù)方法很多，有自體骨移植、異體骨移植、人工骨移植等，最理想的修復(fù)方法是自體骨移植，但是受到供體的限制。近幾年來，長段骨缺損修復(fù)研究越來越多，用于細胞種植的骨移植材料可分為人工和天然兩種，人工材料具有較好的生物相容性、可降解性及可吸收性，但費用昂貴，降解率可塑性低，特別是其酸性代謝產(chǎn)物會降低聚合物周圍的pH值，從而影響細胞核組織生長〔4〕，還可以引起纖維化及可能發(fā)生周圍組織的免疫反應(yīng)〔5〕；天然材料有同種異體骨、異種骨等，作者使用異體軟骨通過脫細胞處理后制作的細胞外軟骨基質(zhì)（extracellularcartilagematrix，ECM）來修復(fù)兔的橈骨5mm缺損，觀察其修復(fù)的效果。結(jié)果表明：ECM復(fù)合骨髓基質(zhì)干細胞（A組）效果最好，其次為B組，較差的為C組，說明ECM可作為骨缺損的修復(fù)組織材料，亦可作為細胞培養(yǎng)支架材料。

3.2ECM的組織結(jié)構(gòu)

ECM只起支持保護細胞和維持滲透壓的作用。近年來，細胞外間質(zhì)的研究發(fā)展非常迅速?，F(xiàn)在研究認為ECM是個“蛋白信使”豐富的環(huán)境，并且軟骨細胞與ECM的相互作用調(diào)節(jié)了許多生物學(xué)過程，這包括了細胞的黏附、生長、分化及生存〔6〕。

ECM生物材料有以下優(yōu)點：（1）經(jīng)過去污劑酶四步法處理制作，去除了軟骨組織的細胞成分，從而去除了存在于有核細胞膜上的主要組織相容性抗原，避免了組織排斥反應(yīng)。（2）ECM主要成分為膠原、彈性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖，這些成分有較好的親水性。（3）ECM具有一定生物活性，促進骨髓基質(zhì)干細胞的增殖、分化等。本試驗中異體ECM在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸有2種結(jié)局：（1）異體ECM部分吸收縮小，在復(fù)合自體骨髓干細胞的修復(fù)組織中，骨髓干細胞在材料支架中遷移、分化和增殖；（2）骨髓干細胞自身分泌一些活性物質(zhì)，激發(fā)其向軟骨細胞及骨細胞轉(zhuǎn)化，從而形成新生骨組織。

3.3骨缺損研究發(fā)展方向

骨髓基質(zhì)干細胞能夠向成骨細胞轉(zhuǎn)化，具有明確的成骨能力。但是單體內(nèi)植入細胞并不能有效地形成新的組織，其主要原因在于以液態(tài)形式注入體內(nèi)的細胞在局部微環(huán)境的作用下，無法保持局部有效濃度，導(dǎo)致新生組織數(shù)量下降。在組織工程化新生骨組織的發(fā)生過程中，生長因子不僅能夠發(fā)揮誘導(dǎo)成骨作用，也能夠促進種子細胞的增殖分化，直接推動骨組織的形成〔7〕。骨缺損移植ECM作為支架，其成骨來源于宿主骨周圍的骨膜〔8〕，成骨活動以軟組織侵入和形成骨吸收陷窩，陷窩內(nèi)的破骨細胞和成骨細胞來源于移植骨質(zhì)周圍的骨髓干細胞〔9〕，吸收和重建同時進行。陷窩逐漸形成管狀結(jié)構(gòu)，周圍有新骨形成，可以觀察到活躍的骨誘導(dǎo)成骨現(xiàn)象。移植后4周可形成較為堅強的骨外痂，該結(jié)合部的主要愈合表面，特別是在骨移植早期為主要的愈合方式。

圖1A組實驗側(cè)（復(fù)合體側(cè)）：10周后標(biāo)本顯示骨缺損已完全骨性連接，外形平滑，骨質(zhì)比較堅硬圖2A組實驗側(cè)（復(fù)合體側(cè)）：10周時陰影密度增大，有大片鈣化，骨量增加，已完全骨性連接，大部分出現(xiàn)不規(guī)則骨髓腔，可見少量骨髓腔相通圖3B組實驗側(cè)（ECM植入側(cè)）：10周時骨缺損處有較多的鈣化，骨量增加，均都部分骨性連接，周圍仍有少部分纖維肉芽組織圖4B組實驗側(cè)（ECM植入側(cè)）：10周時骨缺損處有較多的鈣化，骨量增加，均都部分骨性連接，一部分出現(xiàn)不規(guī)則髓腔圖5對照組：10周時缺損區(qū)大部分為纖維肉芽組織，無明顯新骨形成圖6C對照組：10周時骨缺損區(qū)顯示仍無新骨形成圖7A組實驗側(cè)（復(fù)合體側(cè)）：10周時形成皮質(zhì)骨和成熟骨髓，伴隨骨痂生長，可見骨髓腔相通圖8B組實驗側(cè)（ECM植入側(cè)）：10周時出現(xiàn)交織骨，有少許不規(guī)則髓腔，但仍見軟骨細胞圖9C組對照組：10周后大部分仍可見有缺損，少量地填充肉芽組織目前公認的骨缺損模型為橈骨中段大于1.0cm階段性缺損。Johnson等〔10〕指出實驗性骨缺損需要在一些不利于骨生長的環(huán)境中進行，如果骨缺損超過骨干直徑3～4倍，即不能自行修復(fù)，因為骨局部肌肉覆蓋較少，紅骨髓含量少等。在短期內(nèi)恢復(fù)骨的支撐作用，又可以經(jīng)過一定時間的融合、再塑而實現(xiàn)與宿主骨相同的形態(tài)和功能。

本試驗的結(jié)果表明兔耳廓ECM與自體骨髓干細胞復(fù)合體或單純的ECM來修復(fù)兔橈骨缺損比空白對照組相比具有良好的成骨能力，說明ECM可以作為骨缺損修復(fù)的理想的修復(fù)材料，它的優(yōu)點：取材容易，制作簡單，組織相容性良好，如果對此材料進一步深入的研究和在制作上進一步的改進，將大大地提高使用價值。

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