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篇1

【摘要】 目的：探討白細(xì)胞介素10（interleukin10， IL10）基因的單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotide polymorphism， SNP）與乙型病毒性肝炎（乙肝）后肝硬化中醫(yī)證候的關(guān)聯(lián)。方法：運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism， PCRRFLP）和聚合酶鏈反應(yīng)連接酶檢測(cè)（polymerase chain reactionligase detection reaction， PCRLDR）相結(jié)合的測(cè)序方法，檢測(cè)226例乙肝后肝硬化患者IL10592 A/C、819 C/T和1082 G/A位點(diǎn)的多態(tài)性，分析其基因型和等位基因頻率的分布，以及這3個(gè)SNP位點(diǎn)與乙肝后肝硬化中醫(yī)證候之間的關(guān)系。結(jié)果：IL10819位點(diǎn)C等位基因在脾虛濕盛證出現(xiàn)的頻率明顯高于非脾虛濕盛證（P＜0.001），TT基因型在肝氣郁結(jié)證出現(xiàn)的頻率明顯高于非肝氣郁結(jié)證（P＜0.05）。IL10592 A/C和1082 G/A位點(diǎn)的多態(tài)性與乙肝后肝硬化中醫(yī)證候之間未發(fā)現(xiàn)有顯著的關(guān)聯(lián)（P>0.05）。結(jié)論：IL10819位點(diǎn)C等位基因可能與乙肝后肝硬化患者形成脾虛濕盛證相關(guān)，而其TT基因型可能與肝硬化患者形成肝氣郁結(jié)證相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎; 肝硬化; 多態(tài)性， 單核苷酸; 證候

Methods: The genotypes of IL10592 A/C， 819 C/T and 1082 G/A sites were determined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP)， and polymerase chain reactionligase detection reaction (PCRLDR) combined with the sequencing analysis in 226 cases of posthepatitis B cirrhosis. The genotype and allele frequency distribution， and the relationship between the SNPs and TCM syndromes were analyzed.

Results: The frequency of allele C at IL10819 point in spleen deficiency with overabundance of dampness syndrome was significantly higher than that in nonspleen deficiency with overabundance of dampness (P＜0.01) syndrome， and genotype TT in liver stagnation syndrome was significantly higher than that in nonliver stagnation syndrome (P＜0.05). There was no significant relationship between the polymorphisms of IL10592 A/C， 1082 G/A and the TCM syndromes in posthepatitis B cirrhosis (P>0.05).

Conclusion: In patients with posthepatitis B cirrhosis， allele C in IL10819 locus may be related to spleen deficiency with overabundance of dampness syndrome， and TT genotype in IL10819 locus may be related to liver stagnation syndrome.

Keywords: hepatitis B; liver cirrhosis; polymorphism， single nucleotide; syndrome

肝硬化是我國(guó)臨床最常見(jiàn)的慢性進(jìn)行性肝病，乙型病毒性肝炎（乙肝）是引起肝硬化的主要原因之一。中醫(yī)對(duì)乙肝后肝硬化的診療具有整體動(dòng)態(tài)調(diào)整和個(gè)體化治療的特點(diǎn)，辨證施治不但能改善臨床癥狀及肝功能，提高患者生活質(zhì)量，而且可抑制肝臟炎癥反應(yīng)及纖維組織增生，促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)［1］。闡明中醫(yī)藥個(gè)體化診療有效性的機(jī)制，為中醫(yī)辨證論治尋找客觀的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)中醫(yī)臨床有效診治肝硬化意義重大。本研究基于中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說(shuō)和病證結(jié)合的研究思路，從基因多態(tài)性角度出發(fā)，探討白細(xì)胞介素10（interleukin10， IL10）基因的單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotide polymorphism， SNP）與乙肝后肝硬化中醫(yī)證候的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對(duì)象 自2007年1月到2008年12月，從上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院、曙光醫(yī)院、普陀醫(yī)院和岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收集了226例乙肝后肝硬化病例，年齡為18～65歲，其中男性153例，女性73例。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 乙肝后肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《病毒性肝炎防治方案》［2］。肝硬化中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《肝硬化臨床診斷、中醫(yī)辨證和療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（試行方案）》［3］診斷為肝氣郁結(jié)證（42例）、脾虛濕盛證（38例）、濕熱內(nèi)蘊(yùn)證（39例）、血瘀證（52例）、肝腎陰虛證（46例）和脾腎陽(yáng)虛證（9例）共6個(gè)肝硬化中醫(yī)證型，由3位副主任或主任醫(yī)師分別根據(jù)226例乙肝后肝硬化中醫(yī)臨床資料進(jìn)行辨證分型，對(duì)辨證分型不一致的病例經(jīng)討論后確定其中醫(yī)證型。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 所有乙肝后肝硬化病例均排除由其他肝炎病毒感染或酒精、藥物等其他因素引起的肝硬化。

1.2 研究方法

1.2.1 血液標(biāo)本采集和處理 取病人空腹靜脈血1 mL，置于含有乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid， EDTA）的2 mL凍存管內(nèi)（血液∶EDTA=10∶1），蓋好混勻。3 000 r/min，4 ℃離心5 min，分離上清液，沉淀物即血細(xì)胞，置于－80 ℃冰箱內(nèi)保存，以備DNA提取用。

1.2.2 DNA提取 采用DNA提取試劑盒（TIANGEN），用以上血細(xì)胞來(lái)提取DNA，具體操作參照TIANGEN公司人全血DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 基因型檢測(cè)

1.2.3.1 聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè) IL10592位點(diǎn)的基因多態(tài)性分析采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism， PCRRFLP）方法。IL10592的上游引物是5'GGT GAG CAC TAC CTG ACT AGC3'；下游引物是5'CCT AGG TCA CAG TGA CGT GG3';產(chǎn)物片段：412 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為基因組DNA 2 μL、上下游引物各1 μL（10 μmol/L）、Taq酶（寶生物工程大連有限公司）1 U、10×PCR 緩沖液 2 μL、MgCl2 2 μL（25 mmol/L）和dNTPs 2 μL（2.5 mmol/L），加去離子水補(bǔ)至20 μL。使用DNA循環(huán)合成儀（Ampgene 9700），先94 ℃預(yù)變性5 min，再94 ℃變性45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。將10 μL PCR產(chǎn)物、0.5 μL Afai（寶生物大連工程有限公司）、3 μL去離子水和1.5 μL 10×緩沖液加入同一EP管中，于37 ℃水浴箱中消化2 h。酶切產(chǎn)物加3 μL 6×上樣緩沖液混勻后于3%瓊脂糖凝膠中電泳，90 V水平電泳（Tanon EPs 300）1.5 h。于凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Innotech）下拍照，與分子量標(biāo)記物比較各片段大小。純合子AA基因型為176 bp和236 bp片斷，純合子CC基因型為412 bp片斷，雜合子AC基因型為176 bp、236 bp 和412 bp片斷。

1.2.3.2 聚合酶鏈反應(yīng)連接酶檢測(cè) IL101082G/A和819C/T位點(diǎn)多態(tài)性采用聚合酶鏈反應(yīng)連接酶檢測(cè)（polymerase chain reactionligase detection reaction， PCRLDR）技術(shù)分析。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為基因組DNA 1 μL、上下游引物各0.25 μL（10 μmol/L）、Taq酶0.2 μL、10×PCR 緩沖液 2 μL和 dNTPs 0.3 μL（2.5 mmol/L），加去離子水補(bǔ)至15 μL。先94 ℃預(yù)變性2 min，再94 ℃變性20 s，62 ℃退火 20 s，72 ℃延伸40 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 3 min。以上PCR產(chǎn)物2 μL，10×Taq DNA 連接酶緩沖液1 μL，Taq DNA 連接酶（40 U/μL）0.125 μL，每條探針（10 bp）0.01 μL，加去離子水補(bǔ)至10 μL。先94 ℃ 30 s，再60 ℃ 3 min，共進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。取1 μL連接產(chǎn)物，加2 μL上樣loading Dye 95 ℃變性3 min，立即冰水浴，然后上測(cè)序儀（ABI 377型）檢測(cè)。上下游引物、探針和產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。該實(shí)驗(yàn)過(guò)程和基因型分析在上海捷瑞生物工程有限公司實(shí)驗(yàn)室實(shí)施。

表1 PCRLDR法所用引物、探針和產(chǎn)物大?。裕?/p>

Table 1 Sequences of primers， probes and size of products in PCRLDR

1.2.3.3 測(cè)序 為驗(yàn)證檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，每一個(gè)位點(diǎn)均從所有樣本中隨機(jī)抽取5%的樣本進(jìn)行測(cè)序檢驗(yàn)。測(cè)序委托生物芯片上海國(guó)家工程研究中心實(shí)驗(yàn)室實(shí)施。測(cè)序結(jié)果與以上方法的檢測(cè)結(jié)果一致。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 IL10592 A/C位點(diǎn)的基因型與乙肝后肝硬化中醫(yī)證型的關(guān)系 乙肝后肝硬化患者的中醫(yī)證型與基因型的統(tǒng)計(jì)分析表明，各中醫(yī)證型的AA、AC+CC與中醫(yī)證候基因型總例數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 IL10819 C/T位點(diǎn)的基因型與乙肝后肝硬化中醫(yī)證型的關(guān)系 乙肝后肝硬化患者的中醫(yī)證型與IL10819 C/T位點(diǎn)基因型的統(tǒng)計(jì)分析表明，6個(gè)中醫(yī)證型間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3）。將CT和CC基因型合并后，分析各中醫(yī)證型的TT、CT+CC與中醫(yī)證候基因型總數(shù)之間的差異，在乙肝后肝硬化患者中，CT+CC基因型在脾虛濕盛證中出現(xiàn)的頻率［94.73%（36/38）］明顯高于非脾虛濕盛證［5.26%（2/38）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CT+CC基因型在脾虛濕盛證中出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)比和95%可信區(qū)間為10.055 ［2.360，42.849］，而在非脾虛濕盛證中出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)比和95%可信區(qū)間為0.771 ［0.518，1.147］。另外，TT基因型在肝氣郁結(jié)證中出現(xiàn)的頻率［52.387%（22/42）］明顯高于非肝氣郁結(jié)證［32.07%（59/184）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TT基因型在肝氣郁結(jié)證出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)比和95%可信區(qū)間為1.969 ［1.014，3.824］，而在非肝氣郁結(jié)證出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)比和95%可信區(qū)間為0.845 ［0.560，1.276］。

2.3 IL101082 A/G位點(diǎn)的基因型與乙肝后肝硬化中醫(yī)證型的關(guān)系 乙肝后肝硬化患者中醫(yī)證型與基因型的統(tǒng)計(jì)分析表明，各中醫(yī)證型的AA、AG+GG與中醫(yī)證候基因型總數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表2 乙肝后肝硬化中醫(yī)證型與IL10592 A/C位點(diǎn)的基因型（略）

Table 2 Genotypes of IL10592 A/C and syndrome types of traditional Chinese medicine in posthepatitis B cirrhosis

表3 乙肝后肝硬化中醫(yī)證型與IL10819 C/T位點(diǎn)的基因型（略）

Table 3 Genotypes of IL10819 C/T and syndrome types of traditional Chinese medicine in posthepatitis B cirrhosis

表4 乙肝后肝硬化中醫(yī)證型與IL101082A/G位點(diǎn)的基因型（略）

Table 4 Genotypes of IL101082A/G and syndrome types of traditional Chinese medicine in posthepatitis B cirrhosis

3 討論

證候的研究是中醫(yī)科研的重點(diǎn)、難點(diǎn)和熱點(diǎn)，中醫(yī)的整體觀念和辨證論治往往通過(guò)這一環(huán)節(jié)來(lái)體現(xiàn)。中醫(yī)證候是一種對(duì)患者癥狀和體征的歸納，反映了疾病過(guò)程中機(jī)體某一階段的病因、病位以及病機(jī)等整體病理狀態(tài)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“有諸內(nèi)必形諸外”，疾病證候既然是有規(guī)律的病理表現(xiàn)，就必然有其規(guī)律性的物質(zhì)基礎(chǔ)。中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說(shuō)認(rèn)為體質(zhì)與疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，表現(xiàn)為病理性體質(zhì)是其相關(guān)疾病發(fā)生的主要物質(zhì)基礎(chǔ)［4］。研究證明，人類基因多態(tài)性在闡明人體對(duì)疾病和毒物的易感性與耐受性、疾病臨床表現(xiàn)的多樣性以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)性上都起著重要的作用。由此可見(jiàn)，中醫(yī)的體質(zhì)學(xué)說(shuō)與基因多態(tài)性可能存在內(nèi)在聯(lián)系。

人體的DNA序列及其變異，反映了人類的進(jìn)化過(guò)程。研究不同人群和不同個(gè)體的DNA序列變異，即多態(tài)性，有助于了解人類疾病的發(fā)生、發(fā)展以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)。現(xiàn)已知，至少93％的人類基因都存在SNP［5］，而且SNP已成為遺傳易感性研究的主要生物學(xué)標(biāo)記之一，并與感染性疾病的進(jìn)展有關(guān)［6， 7］。研究表明，中醫(yī)的證型與SNP存在著密切的關(guān)聯(lián)。例如，尤勁松等［8］發(fā)現(xiàn)5HTTLPR多態(tài)性SS型個(gè)體可能是肝火上炎證和肝陽(yáng)上亢證的易感人群，吳依芬等［9］發(fā)現(xiàn)ABCA1基因K等位基因可能是冠心病痰濁證、血瘀證的保護(hù)因素。而且，基因的多態(tài)性在很大程度上還影響疾病的不同證型以及藥物的療效［10］。但迄今為止尚未見(jiàn)有基因多態(tài)性與乙肝后肝硬化證候研究的相關(guān)報(bào)道。

IL10主要由巨噬細(xì)胞分泌，它能下調(diào)Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)，是一種強(qiáng)有力的免疫抑制因子和協(xié)調(diào)刺激分子［11］，從而影響機(jī)體對(duì)乙型肝炎病毒的清除。Miyazoe等［12］的研究提示IL10啟動(dòng)子的多態(tài)性與乙肝的進(jìn)展有關(guān)。

本研究探討了IL10592、819和1082共3個(gè)SNP位點(diǎn)與226例乙肝后肝硬化中醫(yī)證候的關(guān)系。在IL10819位點(diǎn)，脾虛濕盛證C等位基因出現(xiàn)的頻率明顯高于非脾虛濕盛證（P＜0.001），其優(yōu)勢(shì)比約為10，推測(cè)IL10819位點(diǎn)含有C等位基因的肝硬化患者更容易形成脾虛濕盛證。TT基因型在肝氣郁結(jié)證中出現(xiàn)的頻率明顯高于非肝氣郁結(jié)證（P＜0.05），其優(yōu)勢(shì)比約為2，推測(cè)IL10819位點(diǎn)是TT基因型肝硬化患者更容易形成肝氣郁結(jié)證的物質(zhì)基礎(chǔ)。其余兩個(gè)SNP位點(diǎn)（IL10592、1082）基因型與肝硬化的肝氣郁結(jié)證、脾虛濕盛證、濕熱內(nèi)蘊(yùn)證、血瘀證、肝腎陰虛證和脾腎陽(yáng)虛證比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，它們的多態(tài)性可能不影響肝硬化患者中醫(yī)證候的形成。

從虛、實(shí)分類的角度，將肝氣郁結(jié)證、濕熱內(nèi)蘊(yùn)證和血瘀證歸為實(shí)證，肝腎陰虛證和脾腎陽(yáng)虛證歸為虛證，脾虛濕盛證歸為虛實(shí)夾雜證，探討了乙肝后肝硬化實(shí)證、虛證和虛實(shí)夾雜證與IL10592、819和1082共3個(gè)SNP位點(diǎn)基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有顯著的相關(guān)性（結(jié)果未顯示）。

本研究發(fā)現(xiàn)IL10819 C/T位點(diǎn)的多態(tài)性可能是乙肝后肝硬化患者產(chǎn)生某一特定證候的物質(zhì)基礎(chǔ)，且能為肝硬化證候藥物基因組學(xué)研究提供參考。然而，影響肝硬化證候形成的SNP可能會(huì)有許多，仍有大量篩選SNP的工作要做。而且，基因多態(tài)性對(duì)個(gè)體而言是恒定的，證候在肝硬化的發(fā)展過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，具有不確定性。因此，我們需要進(jìn)一步探討肝硬化相關(guān)基因型與證候變化的關(guān)聯(lián)，以期闡明證候的變化規(guī)律。

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