補(bǔ)骨脂平喘作用分析論文

時(shí)間:2022-02-28 04:45:00

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補(bǔ)骨脂平喘作用分析論文

1材料與儀器

1.1動(dòng)物

SD大鼠,70只,SPF級(jí),雌雄各半,180g左右,合格證號(hào):0012625,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2試劑

卵白蛋白批號(hào):970612上?;瘜W(xué)試劑公司;氫氧化鋁干粉批號(hào):20020301-2廣州化學(xué)試劑廠;滅活百日咳桿菌(100億個(gè)/ml)廣東省中醫(yī)院提供;大鼠IL-4(批號(hào)20060620)、IFN-γ(批號(hào)20060620)ELISA試劑盒由晶美生物工程有限公司提供;IL-5(批號(hào)20983008)ELISA試劑盒由BanderMedsystems提供。

1.3補(bǔ)骨脂不同溶劑提取物補(bǔ)骨脂95%乙醇提取物浸膏,濃度:3.45g藥材/ml(簡(jiǎn)稱浸膏);補(bǔ)骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物,濃度:10.0g藥材/ml(簡(jiǎn)稱石油醚萃取物);補(bǔ)骨脂95%乙醇提取醋酸乙酯萃取物,濃度:6.67g藥材/ml(簡(jiǎn)稱醋酸乙酯萃取物);補(bǔ)骨脂95%乙醇提取水萃取物,濃度:10.0g藥材/ml(水萃取物);補(bǔ)骨脂水提取物,濃度:10.0g藥材/ml(簡(jiǎn)稱水提取物);補(bǔ)骨脂95%乙醇提甲醇洗脫物,濃度:2g藥材/ml(簡(jiǎn)稱甲醇洗脫物),以上試劑均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供。

1.4儀器酶標(biāo)儀BIO-RADSModel550,日本;CSW-Ⅰ型超聲霧化器汕頭光電研究所;10L玻璃干燥器。

2方法

2.1分組

將動(dòng)物隨機(jī)分成7組,10只/組:哮喘模型組(給水,1.0ml/100g)、浸膏組(藥材0.9g/100g)、石油醚萃取物組(藥材2.5g/100g)、醋酸乙酯萃取物組(藥材1.7g/100g)、水萃取物組(藥材2.5g/100g)、水提取物組(藥材10.0g/100g)、甲醇洗脫物組(藥材2.5g/100g)。以上各組動(dòng)物連續(xù)灌胃給藥治療10次,1次/d。末次治療后2h,各組動(dòng)物心臟采血5ml,1000r/min離心15min,血清分裝(1ml/管)保存于-70℃低溫冰箱內(nèi)待測(cè):IL-4,IFN-γ,IL-5(嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè))。

2.2卵蛋白哮喘大鼠模型的建立

2.2.1大鼠致敏

上述分組中每只動(dòng)物腹腔注射抗原液0.5ml/100g(含卵蛋白100mg、氫氧化鋁干粉100mg和2.5×109個(gè)百日咳桿菌/ml,制成懸濁液)[7]致敏第1次,次日每只大鼠再次腹腔注射0.5ml/只致敏液加強(qiáng)。

2.2.2激發(fā)和治療

首次致敏后第15天,于每天上午8~9時(shí)大鼠置于10L玻璃干燥器內(nèi)超聲霧化吸入2%卵蛋白20min激發(fā)哮喘,連續(xù)14d。激發(fā)后第4天起,于每天激發(fā)后大鼠口服給相應(yīng)試劑治療(見(jiàn)“2.1實(shí)驗(yàn)分組”)。正常組以生理鹽水取代抗原液按0.5ml/100g腹腔注射致敏大鼠,第2天以0.5ml/只腹腔注射生理鹽水加強(qiáng);首次致敏后第15天,每天上午8~9時(shí)該組大鼠超聲霧化吸入生理鹽水20min激發(fā)哮喘,連續(xù)14d。激發(fā)后第4天起,于每天激發(fā)后大鼠口服給蒸餾水治療。

2.3統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

采用四川大學(xué)黃志勇主編的(PEMS3.0)《中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)·醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)》統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì):兩組均數(shù)比較t檢驗(yàn)(方差齊)或t′(方差不齊)。

3結(jié)果

3.1補(bǔ)骨脂不同溶劑提取物對(duì)哮喘大鼠IL-5含量的影響結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),大鼠服用補(bǔ)骨脂不同溶劑提取物后,血清IL-5含量呈下降趨勢(shì),其中補(bǔ)骨脂浸膏、水萃取物、水提取和甲醇洗脫物各成分組大鼠血清IL-5含量降低明顯,與哮喘模型組比較P<0.05或P<0.01,差異有顯著意義。而石油醚和醋酸乙酯萃取物兩成分組大鼠血清IL-5含量降低不明顯,與哮喘模型組比較P>0.05,無(wú)顯著性差異。

3.2補(bǔ)骨脂不同溶劑提取物對(duì)哮喘大鼠IL-4含量的影響結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),大鼠服用補(bǔ)骨脂不同溶劑提取物后,血清IL-4含量呈升高趨勢(shì),其中補(bǔ)骨脂浸膏、石油醚萃取物和水提取物各成分組大鼠血清IL-4含量升高明顯,與哮喘模型組比較P<0.05或P<0.01,差異有顯著意義。而醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脫物三成分組大鼠血清IL-4含量升高不明顯,與哮喘模型組比較P>0.05,無(wú)顯著性差異。

3.3補(bǔ)骨脂不同溶劑提取物對(duì)哮喘大鼠IFN-γ含量的影響結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),大鼠服用補(bǔ)骨脂不同溶劑提取物后,不同溶劑成分大鼠血清IFN-γ含量升降不一致,其中補(bǔ)骨脂浸膏和石油醚萃取物兩成分組大鼠血清IFN-γ含量升高明顯,與哮喘模型組比較P<0.05,差異有顯著意義。醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脫物三成分組大鼠血清IFN-γ含量減低顯著,與哮喘模型組比較P<0.05或P<0.01,有顯著性差異,而補(bǔ)骨脂水提對(duì)IFN-γ含量未見(jiàn)明顯影響,與哮喘模型組比較P>0.05,無(wú)顯著性差異。表1不同提取物對(duì)哮喘大鼠IL-5,IL-4,IFN-γ含量的影響(略)

3.4補(bǔ)骨脂不同溶劑提取物對(duì)哮喘大鼠Th1/Th2(IFN-γ/IL-5)的影響哮喘模型組、醇提浸膏組、石油醚萃取組、甲醇洗脫物組和水提取物組的Th1/Th2比值依次為(n=10):0.5±0.2,1.1±0.5,0.9±0.5,0.8±0.4和1.2±0.5。提示,大鼠服用補(bǔ)骨脂醇提上述4種溶劑萃取物后,血清Th1/Th2比值呈增加明顯,與哮喘模型組比較P<0.05,差異有顯著意義。而醋酸乙酯萃取物(0.4±0.2,n=10)和水萃取物(0.6±0.2,n=10)兩成分組大鼠血清Th1/Th2降低或增加不明顯,與哮喘模型組比較P>0.05,無(wú)顯著性差異。

4討論

哮喘與Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子及Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4,IL-5等細(xì)胞因子含量和Th1/Th2比值密切相關(guān)。Th2的主要代表產(chǎn)物IL-4,能促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE,引發(fā)炎癥介質(zhì)釋放的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),促進(jìn)炎癥細(xì)胞的趨化聚集,引起呼吸道血管通透性增加和粘膜水腫,平滑肌痙攣及粘液分泌亢進(jìn),是引起哮喘的重要因素。Th1的主要代表產(chǎn)物是IFN-γ,能抑制IL-4,IL-5等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制IgE的產(chǎn)生和Eos活性,抑制IAR和LAR,是哮喘免疫調(diào)節(jié)中的一個(gè)重要的抑制因子,許多細(xì)胞因子通過(guò)它發(fā)揮生物效應(yīng)[8]。因此,采用IFN-γ,IL-5,IL-4作為哮喘敏感指標(biāo)進(jìn)行藥物篩選具有合理性。補(bǔ)骨脂是臨床上常用的補(bǔ)腎助陽(yáng)中藥,具平喘之功,臨床上常用于虛寒喘咳[9]。補(bǔ)骨脂是今后應(yīng)加強(qiáng)研究和開(kāi)發(fā)的抗氣道抗炎癥中藥之一[2]。我院從20世紀(jì)80年代初使用補(bǔ)骨脂注射液治療支氣管哮喘取得了理想的療效,但其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)并不清楚。因此,我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上[2,3],采用卵蛋白哮喘大鼠為模型,以體內(nèi)血清IFN-γ/IL-4/IL-5含量變化為指標(biāo),初步篩選補(bǔ)骨脂平喘作用的有效部位。

從IFN-γ含量變化來(lái)看,補(bǔ)骨脂95%乙醇提取物浸膏和補(bǔ)骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物作用明顯,可能是補(bǔ)骨脂平喘的主要成分,但從抑制IL-5和IL-4含量分析,補(bǔ)骨脂95%乙醇提取水萃取物和補(bǔ)骨脂95%乙醇提甲醇洗脫物對(duì)Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4,IL-5細(xì)胞因子有較強(qiáng)的抑制作用,其他成分卻升高或?qū)L-5,IL-4沒(méi)有顯著影響,而補(bǔ)骨脂水提取物對(duì)IFN-γ含量提高作用不明顯。另外,補(bǔ)骨脂95%醇提水萃取物顯著降低IL-5和IFN-γ含量,同時(shí)在給藥的過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)水萃取物的毒性明顯強(qiáng)于其他成分,這與其腎毒性是否相關(guān)值得關(guān)注。根據(jù)以上分析,我們初步推測(cè)補(bǔ)骨脂平喘有效部位應(yīng)該主要是醇提成分:補(bǔ)骨脂95%乙醇提取物浸膏,補(bǔ)骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物和甲醇洗脫物。

從哮喘中考察Th1/Th2的比值變化更具有意義[10],因此我們以IFN-γ/IL-5為例,分析Th1/Th2的變化,探討補(bǔ)骨脂3個(gè)醇提成分(浸膏、石油醚萃取物和甲醇洗脫物)哪個(gè)為平喘的最佳有效部位。哮喘模型組、醇提浸膏組、石油醚萃取物組和甲醇洗脫物組的Th1/Th2依次為(n=10):0.5±0.2,1.1±0.5,0.9±0.5和0.8±0.4,與哮喘組比較三者的P<0.05,差異有顯著意義,但醇提浸膏的比值更大。因此結(jié)合前面的分析,我們認(rèn)為三者的平喘作用大小依次為:補(bǔ)骨脂95%乙醇提取物浸膏>補(bǔ)骨脂95%乙醇提甲醇洗脫物=補(bǔ)骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物。

【參考文獻(xiàn)】

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【摘要】目的初步篩選補(bǔ)骨脂平喘有效部位。方法建立大鼠哮喘模型,采用ELISA法檢測(cè)補(bǔ)骨脂不同溶劑提取物對(duì)血清IFNγ/IL-4/IL25含量的影響,篩選補(bǔ)骨脂平喘有效部位。結(jié)果①對(duì)IL5含量的影響:醇提浸膏、醇提水萃取物、水提取物和醇提甲醇洗脫物對(duì)血清IL-5含量抑制明顯,而醇提石油醚萃取物、醇提醋酸乙酯萃取物抑制作用不明顯。②對(duì)IL-4含量的影響:醇提浸膏、醇提石油醚萃取物和水提物對(duì)血清IL-4含量有較強(qiáng)的升高作用,而醇提醋酸乙酯萃取物、醇提水萃取物和醇提甲醇洗脫物作用不明顯。③對(duì)IIFNγ含量的影響:醇提浸膏和醇提石油醚萃取物明顯提高IFNγ含量,而醇提醋酸乙酯萃取物、醇提水萃取物和醇提甲醇洗脫物卻降低大鼠體內(nèi)血清IIFNγ含量,水提取物對(duì)IIFNγ含量影響不明顯。結(jié)論補(bǔ)骨脂乙醇提取物浸膏、石油醚萃取物和甲醇洗脫物是補(bǔ)骨脂平喘主要有效部位。

【關(guān)鍵詞】補(bǔ)骨脂哮喘有效部位篩選