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1材料與儀器

桑葉總生物堿提取物為市售產(chǎn)品(DNJ含量>50%)。桑葉、桑椹、桑白皮、桑枝藥材購于成都荷花池中藥材專業(yè)市場，經(jīng)鑒定為Morusalba的干燥葉、果、根皮和嫩枝。硅膠G（青島海浪化工廠）、732陽離子交換樹脂(上海匯珠樹脂有限公司)、中性氧化鋁(成都市科龍化工試劑廠)、活性炭(成都市科龍化工試劑廠)，其余各種試劑為化學(xué)純或分析純。TU-1800紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1桑樹總生物堿分析方法的研究實驗中以桑葉總生物堿提取物為樣品進行了分析方法的研究；后經(jīng)證實，桑椹、桑白皮和桑枝的總生物堿實驗結(jié)果與之一致。

2.1.1檢識反應(yīng)與生物堿沉淀試劑的反應(yīng)：取桑葉總生物堿提取物適量，加蒸餾水溶解，以鹽酸調(diào)pH2～3，過濾，所得溶液為淺黃色，取5份，分別與碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀試劑、硅鎢酸試劑、磷鉬酸試劑、苦味酸試劑反應(yīng)，結(jié)果見表2。表2桑葉生物堿的檢識反應(yīng)（略）

碘化鉍鉀、硅鎢酸、磷鉬酸與樣品呈陽性反應(yīng)，可用于定性鑒別。

亞硝酸反應(yīng)：考慮到DNJ屬于脂肪族仲胺，應(yīng)能與亞硝酸進行反應(yīng)。試驗時取上述桑葉總生物堿提取物的酸水溶液，置試管中，加入亞硝酸鈉水溶液，結(jié)果產(chǎn)生氣泡，持續(xù)時間近1h，隨著氣體的逸出，試管口顏色逐漸變深，幾乎呈褐色，而溶液的顏色則由淺黃色變?yōu)樯铧S色。

2.1.2薄層色譜分析桑樹生物堿的薄層色譜分析鮮有報道，主要是由于DNJ及其類似物顯色困難。實驗中取桑葉總生物堿提取物的水溶液，點樣于硅膠G板上，以醋酸乙酯-甲醇-冰醋酸(6∶2∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，顯色，檢識。曾實驗碘化鉍鉀、磷鉬酸、碘蒸氣、10%硫酸-乙醇、α-萘酚、Enrilich試劑、苯胺-二苯胺-磷酸試劑、0.15%高錳酸鉀等薄層色譜顯色劑，結(jié)果碘化鉍鉀顯色不明顯，其他試劑均未能顯色。

有文獻報道［18］，采用茚三酮試劑能使DNJ顯紫色斑點。經(jīng)試驗，茚三酮能使樣品的薄層板顯出斑點，但是，用茚三酮顯色不能排出氨基酸的干擾，而亞硝酸反應(yīng)產(chǎn)生氣泡表明樣品中可能存在氨基酸。后終于找到氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑，能使樣品的薄層板顯紅黃色斑點。若令薄層板不顯色，刮取氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑能顯色的相應(yīng)位置的硅膠，以甲醇洗脫，洗脫液揮除溶劑，酸水溶解，加碘化鉍鉀試劑，結(jié)果呈陽性反應(yīng)，表明氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑能使桑葉生物堿顯色。又取谷氨酸水溶液，與桑葉總生物堿提取物平行試驗，結(jié)果，氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑不能使谷氨酸顯色。因此，桑葉總生物堿用氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑顯色具有專屬性。氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑顯色的具體方法為：取少量高錳酸鉀置密閉容器中，加適量濃鹽酸令產(chǎn)生氯氣，將薄層板放入，15min后取出，置空氣中5min以上以除去氯氣，然后噴以鄰聯(lián)甲苯胺溶液(160mg鄰聯(lián)甲苯胺溶于30ml冰醋酸，加水至500ml，再加1g碘化鉀)，即可顯色。桑葉生物堿提取物的薄層色譜圖如圖2所示。

2.1.3含量測定方法的提出實驗發(fā)現(xiàn)，桑葉生物堿經(jīng)氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑顯色后，在2h內(nèi)未見褪色，5h后慢慢褪色，顯色較為穩(wěn)定。刮取斑點，用甲醇洗脫，取洗脫液在200～800nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在209nm和446nm處有吸收峰，如圖3所示。后來發(fā)現(xiàn)，若樣品薄層色譜中有多個斑點，這些斑點的光譜圖基本一致。據(jù)此可提出含量測定方法：以DNJ為對照品，用薄層色譜-分光光度法進行測定。

由于209nm屬于末端吸收峰，若用于含量測定則誤差較大，故宜選用446nm作測定波長。經(jīng)試驗，甲醇洗脫液放置2h，446nm處的吸光度值基本不變，表明方法的耐用性良好。因此確定總生物堿的含量測定方法可采用薄層色譜-可見分光光度法。

另外，根據(jù)斑點顏色清晰、穩(wěn)定、以及不同斑點光譜圖基本一致的性質(zhì)，也可以考慮以DNJ為對照品，用薄層掃描法進行含量測定。

2.2桑樹總生物堿提取方法的研究本文桑樹總生物堿的提取、純化是建立在對結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的分析的基礎(chǔ)之上的。

2.2.1根據(jù)桑樹生物堿的結(jié)構(gòu)推測其理化性質(zhì)

溶解性：由表1可知，DNJ類化合物為氮雜糖型結(jié)構(gòu)，羥基較多，極性較大，因此可溶于水、醇類溶劑，在氯仿等弱極性溶劑中、醋酸乙酯等中等極性溶劑中應(yīng)不能溶解或溶解度很小，因此，傳統(tǒng)的生物堿提取方法(酸水提取、氯仿萃取)將不適用，但可考慮用水、醇類溶劑提取。

堿性：由表1可知，桑樹生物堿多為脂肪族仲胺或叔胺，因此具有弱堿性，在一定pH條件下能成為離子狀態(tài)，故可以考慮用離子交換色譜進行純化。另外，也以考慮使用氧化鋁等堿性吸附劑進行分離。

水解性：對于氮雜糖本身而言，其化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，在酸、堿、熱作用下不易分解。但根據(jù)表1，不少生物堿成分以糖苷的形式存在，苷在酸性條件下尤其是加熱時易被水解，因此，提取分離中若使用酸時應(yīng)注意不能使作用時間太長，并應(yīng)盡量避免在酸性條件下加熱。

2.2.2桑樹生物堿的提取工藝流程根據(jù)上述結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的分析，本文提出了以下的提取工藝流程。各提取步驟分別進行沉淀反應(yīng)和薄層色譜跟蹤分析，以保證各工序所得到的成分為生物堿。

水提醇沉：取桑葉、桑椹、桑白皮、桑枝藥材，分別加水煎煮提取，煎液濃縮至一定體積，放冷后加乙醇使含醇量達70%，靜置過夜，濾取上清液，回收乙醇，得提取液。

離子交換樹脂富集：取上述提取液，適當(dāng)稀釋，用10%鹽酸調(diào)pH4～5，流經(jīng)已預(yù)處理的732陽離子交換樹脂柱，樹脂柱先以水洗至近中性，棄去水洗液，再用0.25mol/L氨水洗脫，收集洗脫液，適當(dāng)濃縮。

正丁醇萃?。喝∩鲜鰸饪s液，以等量的水飽和的正丁醇萃取，共3～4次，分取正丁醇層，減壓回收溶劑，得正丁醇萃取物。

氧化鋁柱層析：取正丁醇萃取物，用少量水溶解，上樣于氧化鋁干柱，以乙醇洗脫，洗脫液回收乙醇，得氧化鋁純化物。

活性炭脫色：取氧化鋁純化物，以水溶解，加適量活性炭，煮沸15min，放冷，過濾，濾液濃縮除去溶劑，即得到總生物堿產(chǎn)品。

2.2.3產(chǎn)品的初步分析

沉淀反應(yīng)：取上述產(chǎn)品，加水溶解，以鹽酸調(diào)pH2～3，分別加碘化鉍鉀試劑、硅鎢酸試劑、磷鉬酸試劑，結(jié)果4味藥的總生物堿均呈陽性反應(yīng)。

薄層色譜分析：薄層色譜條件同上。結(jié)果如圖4所示。

3討論

中藥有效成分的分析方法與提取方法建立的前提是對目標(biāo)成分理化性質(zhì)有充分的認(rèn)識。本文在分析桑樹生物堿結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的基礎(chǔ)上，根據(jù)實驗結(jié)果提出了桑樹總生物堿的新的定性定量方法和提取分離方法，方法可行性較好，但方法中的具體參數(shù)仍有待進一步研究，所得總生物堿的含量尚待測定。

曾考慮采用酸性染料比色法進行桑樹總生物堿的定量分析，但實驗發(fā)現(xiàn)該方法干擾很大。

亞硝酸反應(yīng)中，有氣體產(chǎn)生，表明樣品應(yīng)存在含伯胺基的化合物，很有可能是氨基酸。后用谷氨酸進行亞硝酸反應(yīng)，結(jié)果能產(chǎn)生大量氣體。

薄層色譜圖中，點樣原點亦明顯顯色，表明可能有部分生物堿成分停留在原點尚未展開，因此本文的薄層色譜條件尚需優(yōu)化。

氯-鄰聯(lián)甲苯胺試劑使桑樹生物堿顯色的原理可能是：新生態(tài)氯使生物堿氯代，然后氯代物與鄰聯(lián)甲苯胺發(fā)生縮合反應(yīng)生成聯(lián)苯醌而顯黃色［19］。

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【摘要】目的研究桑樹總生物堿的分析方法和提取方法。方法采用理化反應(yīng)和薄層色譜對桑葉生物堿進行定性定量分析。通過對桑樹生物堿成分的結(jié)構(gòu)特征的分析設(shè)計提取純化方法。結(jié)果發(fā)展了桑樹生物堿的薄層色譜方法，給出了從桑葉、桑椹、桑白皮和桑枝中提取總生物堿的方法。結(jié)論薄層色譜-可見分光光度法可用于桑樹總生物堿的定量分析，所提出的總生物堿提取方法具有可操作性。

【關(guān)鍵詞】桑樹；總生物堿；分析方法；提取方法