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【摘要】目的研究轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根中的化學(xué)成分。方法采用硅膠、SephadexLH-20、ODS柱色譜等方法分離何首烏毛狀根中的化學(xué)成分，并根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果從何首烏毛狀根60％乙醇提取物中分離得到了12個(gè)化合物。利用理化性質(zhì)及波譜技術(shù)確定其結(jié)構(gòu)分別為：2,3,5,4''''-四羥基反式二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(1)、沒(méi)食子酸(2)、沒(méi)食子酸甲酯(3)、3,5-二羥基苯甲酸(4)、丁香酸(5)、對(duì)羥基苯甲酸(6)、胡蘿卜苷(7)、β-谷甾醇(8)、豆甾醇(9)、煙酸(10)、碳直鏈?zhǔn)咚?11)、碳直鏈三十一酸(12)。結(jié)論上述12個(gè)化合物均為首次從轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根中分離得到；化合物3，4，5，6為首次從該種植物中分離得到。

【關(guān)鍵詞】何首烏毛狀根化學(xué)成分

Abstract：ObjectiveTostudythechemicalconstituentsfromthetransgenichairyrootsofPolygonummultiflorumThunb..MethodsThecompoundsI-XIIwereisolatedbyacombinationofsilicagel,SephadexLH-20,andODSchromatographictechnologiesandtheirstructureswereidentifiedbyspectralmethods.ResultsTwelveknowncompoundswereisolatedfromhairyrootsofP.multiflorum.Theirstructureswereidentifiedbymeansofspectroscopicanalysisas:2,3,5,4''''-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside(1),gallicacid(2),methylgallate(3),3,5-dihydroxybenzoicacid(4),3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoicacid(5),p-hydroxybenzoicacid(6),daucosterol(7),β-sitosterol(8),stigmasterol(9),nicotinicaicd(10),n-CH3(CH2)15COOH(11),n-CH3(CH2)29COOH(12).ConclusionAllcompoundsareisolatedfirstlyfromtransgenichairyrootsofP.multiflorumandcompounds3～6areisolatedfromP.multiflorumforthefirsttime.

Keywords：Polygoniummultiflorum；Hairyroots；Chemicalconstituents

何首烏，又名首烏、赤首烏，為蓼科植物何首烏PolygonummultiforumThunb.的干燥塊根。其性微溫、氣微、味微苦而甘澀，有解毒、消瘡癰、潤(rùn)腸通便等功能，可用于肝腎精血虧虛、頭昏目眩、須發(fā)早白等病癥的治療［1］。何首烏的化學(xué)成分主要為蒽醌類(lèi)、二苯乙烯苷類(lèi)、酚酸類(lèi)以及卵磷脂等化合物類(lèi)型［2］。

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，基因工程的研究成果滲透到細(xì)胞工程中來(lái)，引起了細(xì)胞培養(yǎng)研究的新突破。其中通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)中Ri質(zhì)粒介導(dǎo)的天然植物遺傳轉(zhuǎn)化，建立發(fā)根培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)原植物中的次生代謝產(chǎn)物成為植物基因工程和細(xì)胞工程相結(jié)合的一項(xiàng)新技術(shù)。轉(zhuǎn)基因毛狀根（transgenichairyroots）能夠在無(wú)激素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且其生長(zhǎng)速度大大高于其相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)物和未轉(zhuǎn)化的根培養(yǎng)物［3］，具遺傳性狀穩(wěn)定、次生代謝產(chǎn)物含量高等優(yōu)點(diǎn)［4］。本實(shí)驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)上，對(duì)轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根進(jìn)行了較系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，從中分離得到12個(gè)單體。本文報(bào)道其分離和鑒定工作。

1儀器與材料

熔點(diǎn)用北京泰克儀器有限公司X-4數(shù)顯顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定；NMR用VARIANINOVA-400型核磁共振儀測(cè)定。所用溶劑為工業(yè)級(jí)試劑經(jīng)過(guò)重蒸處理；SephadexLH-20為瑞士安瑪西亞公司產(chǎn)品；RP-18為美國(guó)默克公司產(chǎn)品；柱層析硅膠和薄層層析硅膠(GF254)均為青島海洋化工廠產(chǎn)品。

何首烏毛狀根由本室誘導(dǎo)獲得。PCR和Southern雜交表明發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中的T-DNA已經(jīng)整合到何首烏細(xì)胞核的基因組中［3］。

2方法與結(jié)果

2.1提取與分離何首烏毛狀根450g(DW)，粉碎后經(jīng)60％乙醇加熱回流提取5次，2h/次。減壓濃縮得浸膏。浸膏用水分散，依次以石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮醋酸乙酯和正丁醇萃取液分別得到浸膏A（50g）和浸膏B（10g）。浸膏A用300～400目的硅膠柱分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫。氯仿-甲醇(90：10)洗脫部分，經(jīng)SephadexLH-20柱分離，得化合物8，9，11和12；氯仿-甲醇(85：15)洗脫部分，經(jīng)SephadexLH-20柱分離，ODS純化得化合物2，3和7；氯仿-甲醇(80：20)洗脫部分，經(jīng)RP-18純化得化合物1。浸膏B用200～300目的硅膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇(4:1)洗脫，再經(jīng)反復(fù)SephadexLH-20和ODS柱純化，得化合物1，2，4，5，6和10。

2.2結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1化合物1

白色無(wú)定形粉末(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，乙醇。IR(KBr)cm-1：3420,1606,1515。ESI-MS:407［M+H］+，379［M-CH2=CH2+H］+；1H-NMR［400MHz，CD4O］δ:3.3-3.8(6H，m，糖上H)，4.54(1H，d，J=8.0Hz，H-1'''''''')，6.28(1H，d，J=2.4Hz，H-4)，6.58(1H，d，J=2.4Hz，H-6)，6.80(2H，d，J=8.0Hz，H-3'''',5'''')，6.96(1H，d，J=16.0Hz，H-2a)，7.49(2H，d，J=8.0Hz，H-2'''',6'''')，7.75(1H，d，J=16.0Hz，H-1a)；13C-NMR［100MHz，CD4O］δ:158.3(C-4'''')，155.9(C-5)，152.0(C-3)，137.9(C-2)，133.6(C-1'''')，130.8(C-2a)，130.0(C-2'''',6'''')，129.2(C-1a)，121.6(C-1)，116.4(C-3'''',5'''')，108.2(C-6)，103.5(C-1'''''''')，102.6(C-4)，78.1(C-5'''''''')，77.9(C-3'''''''')，75.4(C-2'''''''')，70.6(C-4'''''''')，62.7(C-6'''''''')。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)［2］對(duì)比基本一致。故確定化合物1為2,3,5,4''''-四羥基反式二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,5,4''''-te-trahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside)。

2.2.2化合物2

淡棕色針狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，乙醇。mp235～238℃，F(xiàn)eCl3反應(yīng)陽(yáng)性。IR(KBr)cm-1：3434,1715,1629,1363,1092；ESI-MS:171［M+H］+，169［M-H］-；1H-NMR［400MHz,CD4O］δ:4.76(3H，s，3×ArOH)，7.09(2H，brs，2×Ar-H)；13C-NMR［100MHz，CD4O］δ:170.5(C=O)，146.3(C-3,5)，139.6(C-4)，121.8(C-1)，l10.3(C-2,6)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5，6］基本一致，故將化合物2鑒定為沒(méi)食子酸(gallicacid)。

2.2.3化合物3

白色固體粉末(氯仿-甲醇)。IR(KBr)cm-1：3362,1693,1536,1330,1263,1213,765；ESI-MS:185［M+H］+；1H-NMR［400MHz,CD4O］δ:3.85(3H,s,COOCH3),7.08(2H,s,H-2,6)；13C-NMR［100MHz，CD4O］δ:169.2(C=O)，146.5(C-3,5)，139.8(C-4)，121.3(C-1)，109.9(C-2,6)，52.3(OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6，7］基本一致，故鑒定該化合物為沒(méi)食子酸甲酯（methylgallate)。

2.2.4化合物4

白色結(jié)晶性粉末(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，乙醇。mp235～237℃。FeCl3反應(yīng)陽(yáng)性。IR(KBr)cm-1：3442,1682,1610,1482,1402,917,851,766；ESI-MS:155［M+H］+；1H-NMR［400MHz，CD4O］δ:6.49(1H，t，J=2.4Hz，H-4)，6.97(2H，d，J=2.4Hz，H-2,6)；13C-NMR［100MHz，CD4O］δ:170.0(C=O)，159.7(C-3,5)，133.7(C-1)，119.0(C-2,6)，108.1(C-4)。根據(jù)以上光譜數(shù)據(jù)鑒定該化合物為3,5-二羥基苯甲酸(3,5-dihydroxybenzoicacid)。

2.2.5化合物5

白色針晶(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇。mp212～213℃，F(xiàn)eCl3反應(yīng)呈陽(yáng)性。IR(KBr)cm-1：3383,1699,1619,1522,1460,1373,1205,1114,865；ESI-MS:197［M-H］-;1H-NMR［400MHz，CD4O］δ:3.93(6H，s，OCH3×2)，7.37(2H，s，H-2,6)；13C-NMR［100MHz，CD4O］δ:169.9(COOH)，148.8(C-3,5)，141.7(C-4)，121.9(C-1)，108.3(C-2,6)，56.8(OCH3×2)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8，9］基本一致，故化合物5鑒定為丁香酸(syringicacid)。

2.2.6化合物6

白色針狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，F(xiàn)eCl3反應(yīng)呈陽(yáng)性。IR(KBr)cm-1:3396,2924,2651,2543,1673,1608,1594,1510,1448,1424,1320,1244,1169；ESI-MS:139［M+H］+；1H-NMR［400MHz，CD4O］δ:6.85(2H，dd，J=7.2,2.4Hz，H-3,5)，7.9l(2H，dd，J=7.2,2.4Hz，H-2,6)；13C-NMR［100MHz，CD4O］δ:170.1(C=O)，163.4(C-4)，133.0(C-2,6)，122.7(C-1)，116.0(C-3,5)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10，11］基本一致，化合物6鑒定為對(duì)羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoicacid)。

2.2.7化合物7

白色無(wú)定型粉末(甲醇)，難溶于氯仿、丙酮，微溶于甲醇，易溶于吡啶。mp282～284℃。254nm下無(wú)紫外吸收，與10%硫酸乙醇溶液反應(yīng)顯紫紅色，與磷鉬酸反應(yīng)顯藍(lán)色，初步推斷化合物為萜類(lèi)或甾體化合物。TLC結(jié)果顯示Rf值與胡蘿卜苷標(biāo)準(zhǔn)品一致。且混合后熔點(diǎn)不下降，故將該化合物鑒定為胡蘿卜苷(daucosterol)。

2.2.8化合物8

白色片狀結(jié)晶。1H-NMR［400MHz，CDCl3］δ:0.68(3H，s，H-18)，0.80(3H,t，J=8.0Hz，H-29)，0.85(6H,d,J=7.2Hz，H-26,27)，0.92(3H,d，J=7.2Hz，H-21)，1.01(3H，s，H-19)，3.52(1H,m,H-3)，5.36(1H,m,H-6)。以上光譜數(shù)據(jù)與β-谷甾醇文獻(xiàn)值［12］基本一致，故將其鑒定為β-谷甾醇(β-sitosterol)。

2.2.9化合物9

白色片狀結(jié)晶。1H-NMR［400MHz，CDCl3］δ:0.79(3H，s，H-18)，0.80(3H,t，J=8.0Hz，H-29)，0.87,0.83(3H,each，brs，H-26,27)，1.04(3H，s，H-19)，1.05(3H，brs，H-21)，5.03(1H,dd,J=8.5Hz，15.0Hz，H-23)，5.15(1H，dd，J=8.5，15.0Hz，H-22)，5.36(1H，brd，J=4.4Hz，H-6)。根據(jù)以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］對(duì)照，鑒定該化合物為豆甾醇(stigmasterol)。

2.2.10化合物10

白色針晶。mp234～237℃。ESI-MS:124［M+H］+，80［M-CO2+H］＋；1H-NMR［400MHz，DMSO-d6］δ:7.55(1H，dd，J=8.0,4.8Hz，H-5)，7.78(1H，d，J=4.8Hz，H-6)，8.26(1H,d,J=8.0Hz，H-4)，9.072(1H,brs，H-2)；13C-NMR［100MHz，DMSO-d6］δ:166.5(COOH)，153.5(C-2)，150.4(C-6)，137.2(C-4)，126.8(C-3)，124.0(C-5)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］基本一致,該化合物鑒定為煙酸(nicotinicaicd)。

2.2.11化合物11

白色固體粉末，易溶于氯仿。ESI-MS:269［M-H］-；1H-NMR［400MHz，CDCl3］δ:0.88(3H,t,J=6.8Hz,CH3)，2.38(2H,t，J=7.6Hz,α-CH2)?；衔镨b定為碳直鏈?zhǔn)咚帷７肿邮綖椋簄-CH3(CH2)15COOH。

2.2.12化合物12

白色固體粉末，易溶于氯仿。ESI-MS:465［M-H］-；1H-NMR［400MHz，CDCl3］δ:0.88(3H，t，J=6.8Hz，CH3)，2.38(2H，t，J=7.6Hz，α-CH2)。綜合以上數(shù)據(jù)，將化合物12鑒定為碳直鏈三十一酸。分子式為：n-CH3(CH2)29COOH。

3討論

本研究組對(duì)何首烏毛狀根中的蒽醌類(lèi)成分已有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行了較系統(tǒng)的化學(xué)成分研究。從中分離到12個(gè)單體，均為首次從轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根中分離得到；其中化合物3，4，5，6為首次從該種植物中分離得到。

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