導(dǎo)語：百日咳毒素病毒重組研究論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要目的：百日咳毒素既是百日咳桿菌的主要毒性因子，又是重要的保護性抗原，其S1亞單位具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性和免疫保護性決定簇。為高效表達前構(gòu)建的一個喪失酶活性但仍保持保護決定簇的S1變異子，開展了本研究。方法：通過添加人流感病毒血凝素基因信號序列或嵌膜序列的方法，對天然和變異S1亞單位基因片段作了遺傳學(xué)修飾。然后使用重組桿狀病毒技術(shù)使這些S1亞單位在昆蟲細(xì)胞和昆蟲幼蟲中實現(xiàn)了高水平表達。結(jié)果：這些重組S1的表達水平介于每萬個昆蟲卵細(xì)胞0.18～1.93μg或每只昆蟲幼蟲0.46～4.98mg之間。天然信號肽和HA信號肽均可完整表達，但后者的切割效率(61%～81%)比前者(16%～19%)更高。所有帶信號肽的S1亞單位均呈異質(zhì)性表達(雙帶)。結(jié)論：重組S1亞單位的表達是高效和正確的，表達的異質(zhì)性是由于信號肽切割不完全的緣故。

關(guān)鍵詞百日咳毒素S1亞單位重組桿狀病毒表達

ExpressionofgeneticallyalteredS1subunitsofpertussistoxininrecombinantbaculoviruses

YUKang-Zhen.

HarbinVeterinaryResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150001

BurnetteWN,KaslowHR,MarVLetal.

InternationalLaboratoryofMolecularBiologyforTropicalDiseaseAgents,SchoolofVeterinaryMedicine,UniversityofCalifornia,Davis,CA95616

AbstractObjective:Pertusistoxin(PT)isbothamajorvirulencefactorofbordetellapertussisandanimportantimmunoprotectiveantigenagainstwhoopingcough.TheS1subunitofPTpossessesADP-ribosyltransferaseactivityaswellasepitopesthatinduceprotectiveimmunity.TheaimofthepresentresearchistoproducetheS1mutantabundantlywhichisinlackoftheenzymeactivityconstructedpreviously.Methods:HavemodifiedbothnativeandmutantS1subunit-encodingDNAfragmentsbytheadditionofthenativeS1signalsequenceorthesignalsequenceofhumaninfluenzavirushemagglutinin(HA)gene.ThemodifiedS1subunitswereabundantlyexpressedbyrecombinantautographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirusesininsectcellsandlarva.Results:Theexpressionlevelsrangedfrom0.18～1.93μg/104spodopterafrugiperdaovariancells,or0.46～4.98mg/larvaofspodopteraexigua.ThenativeandHAsignalsequenceswerebothexpressedintact,althoughtheHAsignalwasprocessedmoreefficiently(61%～81%)tnanthenativeone(16%～19%).AllS1withsignalsproducedtwobands.Conclusion:AllrecombinantS1subunitswereproducedcorrectlytohighlevels.TheheterologousexpressionofrS1proteinsistheresultofincompletesignalcleavage.

KeywordsPertussistoxin(PT)S1subunitRecombinantbaculovirus(rBV)Expression

百日咳是一種嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，有時伴有神經(jīng)癥狀。其病原菌——百日咳桿菌能產(chǎn)生十多種毒性因子，其中的百日咳毒素(PT)是一種外毒素，由5種不同亞單位組成A-B結(jié)構(gòu)。A結(jié)構(gòu)即S1亞單位，分子量為26kD，具有鳥嘌呤結(jié)合蛋白(G蛋白)特異性核糖轉(zhuǎn)移酶活性，而G蛋白與腺苷酸環(huán)化酶抑制信號的傳導(dǎo)有關(guān)。由于PT可與多種細(xì)胞結(jié)合，從而抑制G蛋白介導(dǎo)的多種信號傳遞系統(tǒng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。傳統(tǒng)百日咳疫苗的毒副作用與S1亞單位的酶活性有關(guān)。近年研究均致力于S1亞單位的遺傳學(xué)脫毒。Burnette等應(yīng)用定點突變術(shù)構(gòu)建了一種S1變異子(Arg9→Lys，或R9→K)［1］，其酶活性降至陰性對照水平，但仍保持其保護性抗原決定簇，這為安全有效的新型百日咳疫苗的研制打下了基礎(chǔ)。重組桿狀病毒(rBV)載體以其高效、真實地表達外源基因的特性而被廣泛應(yīng)用。本研究中，我們對天然及變異S1亞單位編碼基因進行了一系列分子修飾，并用rBV載體系統(tǒng)高水平地表達了這些重組S1亞單位，為其免疫學(xué)特性評價奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株、病毒及細(xì)胞系大腸桿菌DH5α株用于質(zhì)粒擴增；野生型桿狀病毒Autographacalifornia核多角體病毒株(wtAcNPV)用于同源重組；昆蟲(Spodopterafrugiperda)卵細(xì)胞系Sf9和Sf21用于rBV增殖和蛋白質(zhì)表達。

1.2主要試劑工具酶及DNA標(biāo)記試劑盒(BoehringerMannheim)；桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVL1392和pVL1393(Invitrogen)；PT及S1亞單位(ListBiologicalLaboratory公司)；兔抗PT高免血清的制備見文獻［2］；抗S1亞單位單克隆抗體1B7由Sato博士惠贈［3］；堿性磷酸酶標(biāo)記的多克隆羊抗兔或鼠IgG抗體(ZymedLaboratory公司)；蛋白定量試劑盒(Sigma)。

1.3S1亞單位編碼基因的修飾在編碼天然S1亞單位DN段的克隆和定點突變的基礎(chǔ)上［1，2］，使用pUC18及pUC19載體構(gòu)建了遺傳學(xué)修飾的S1DNA克隆(圖1)。流感病毒血凝素(HA)信號序列(77bp)和嵌膜序列為人工合成［4，5］。應(yīng)用雙脫氧序列分析技術(shù)確證這些S1DN段序列的正確性。

圖1S1亞單位編碼基因的分子修飾

Fig.1ModificationofS1DNAmolecules

1.4桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建上述8種pUC重組質(zhì)粒(pUCS1)分離相應(yīng)的S1DN段，分將其亞克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1392或pVL1393(視克隆方向而定)中。原位雜交和酶切分析篩選和鑒定重組pVL質(zhì)粒(pVLS1)。

1.5DNA轉(zhuǎn)染及rBV純化采用線性AcNPV轉(zhuǎn)染技術(shù)(Invitrogen公司)。3輪蝕斑篩選和純化后將斑點雜交和免疫斑點試驗雙陽性的病毒蝕斑克隆在Sf9細(xì)胞中增殖。

1.6原位及斑點雜交采用隨機引物標(biāo)記技術(shù)將S1/2DN段經(jīng)32P標(biāo)記后用作探針，檢測重組菌落的rBVs中的S1DNA。菌落的原位雜交按常規(guī)方法進行。斑點雜交時先將rBV感染的細(xì)胞用1mol/LNaOH裂解后加到硝酸纖維素膜上，進行雜交。

1.7SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、免疫印跡(Westernblot)和免疫斑點(Immunoblot)試驗

1.7.1SDS-PAGE感染樣品(Sf21細(xì)胞、昆蟲幼蟲或血淋巴)經(jīng)SDS-PAGE分離，分離膠濃度為12%。以純化的PT作陽性對照，wtAcNPV感染的昆蟲幼蟲或表達牛水皰性口炎病毒核蛋白(VSV-N)的rBV感染的Sf21細(xì)胞用作陰性對照［6］。

1.7.2免疫印跡參照文獻［7］進行。以兔抗PT高免血清、抗S1亞單位的單克隆抗體(1B7)和堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔(或鼠)IgG用于免疫學(xué)檢測。

1.7.3免疫斑點方法與免疫印跡相似，不同：1.待測樣品經(jīng)超聲裂解后溶于Tris緩沖鹽溶液(TBS，pH7.4)中，然后直接點到PVDF(polyvinylidenedifluoride)膜上；2.純化的S1亞單位作rS1定量的標(biāo)準(zhǔn)。PVDF膜用輕礦物油透明后進行定量掃描分析。

1.8rS1表達水平的測定

1.8.1rS1表達動力學(xué)分析用10個感染量(m.o.i.)的rBV感染Sf21細(xì)胞，在不同時間收集這些細(xì)胞，進行免疫斑點試驗，分析rS1亞單位的表達動力學(xué)，以據(jù)此在最佳時間收集表達的S1蛋白。此外，用5×105個蝕斑形成單位(pfu)的rBV感染昆蟲幼蟲(Spodopteraexigua，體重0.65～0.71g)，感染后第4天收集幼蟲及其血淋巴。

1.8.2rS1表達量的測定rBV感染的昆蟲細(xì)胞或昆蟲幼蟲懸液總蛋白用蛋白定量試劑盒(Lowry法)測定。對每個樣品進行SDS-PAGE分析，根據(jù)rS1蛋白在總蛋白中的百分比和總蛋白濃度計算出每種rS1亞單位的表達量。除使用該物理定量法外，還同時應(yīng)用免疫斑點試驗(免疫定量法)測定了每種rS1亞單位的表達量。

1.9rS1亞單位信號肽處理的分析將rS1蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用考馬斯亮藍(lán)染色。將rS1條帶逐一切下，加到ABI477氣相微量序列測定儀中作N端氨基酸序列分析(10個循環(huán))。同時，rS1蛋白經(jīng)免疫印跡分析并用輕礦物油對印跡膜透明處理后，對特異條帶體積進行定量掃描。微量序列分析證實低分子量條帶缺乏信號肽以及高分子量條帶含有信號肽后，信號肽的切割效率按低分子量條帶體積與兩條帶總體積之比計算。

2結(jié)果

2.1rBVs的構(gòu)建將修飾后的S1DNA分子從相應(yīng)pUCS1質(zhì)粒中切下并分別亞克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中。然后通過重組pVLS1DNA和wtAcNPVDNA在Sf9細(xì)胞中的同源重組獲得rBV。蝕斑純化后，利用免疫斑點或免疫印跡試驗篩選出了可表達8種不同rS1蛋白的rBV。

2.2rS1亞單位的表達8種不同rBV在昆蟲細(xì)胞中的表達動力學(xué)表明，病毒感染后72h，rS1蛋白的表達水平最高。由于昆蟲幼蟲多在感染后5～6d死亡，故收獲rS1蛋白的最佳時間為接毒后第4天。應(yīng)用SDS-PAGE和免疫印跡(圖2、3)以及免疫斑點試驗對rS1蛋白在昆蟲細(xì)胞和幼蟲中的表達情況作了分析，并測定了每種rS1亞單位的表現(xiàn)分子量(MW)，見表1。結(jié)果表明，缺少信號肽的rS1呈現(xiàn)單一條帶，其表現(xiàn)MW與理論值一致，而帶信號肽的rS1亞單位均呈雙帶，并其表現(xiàn)MW與理論MW有細(xì)微差別。帶天然信號序列的rS1表達水平最高，帶流感病毒信號序列的rS1次之，而無信號序列或帶流感病毒信號和嵌膜序列的rS1表達量最低。免疫定量法與物理定量法測得的表達量有明顯差異，這表明天然和重組S1亞單位的免疫反應(yīng)性可能不同。

2.3rS1亞單位信號序列的處理每種rS1條帶氨基端的微量序列分析表明有4種不同的N-末端存在(表2)，即：天然信號肽(Met-Arg-Cys-Thr-Arh-Ala-Ile-Arg-Gln-Thr)，天然S1亞單位(Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arg-Tyr)，變異S1亞單位(Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Lys-Tyr)，流感病毒信號肽(Met-Lys-Ala-Lys-Leu-Leu-Val-Leu-Leu-Tyr)。這表明細(xì)菌信號肽和流感病毒信號肽的處理是正確的，但不完全。在該真核表達系統(tǒng)中，流感病毒信號肽較天然細(xì)菌信號肽的切割更有效。

圖2rS1亞單位在Sf21昆蟲細(xì)胞中表達的免疫印跡分析

Fig.2WesternblotanalysisofinsectcellsinfectedwithrBVs

圖3rS1亞單位在昆蟲幼蟲中表達的免疫印跡分析

Fig.3WesternblotanalysisofinsectinfectedwithrBVs表1rS1亞單位在昆蟲細(xì)胞和幼蟲中的表達情況

Tab.1ExpressionofrS1subunitsininsectcellsandlarva

rS1subunitPredicted

MW(kD)Apparent

MW(kD)%age1)Expressionlevel1)Expressionlevel2)

Sf21Larvaμg/104Sf21mg/larvang/104Sf21μg/larva

129.72814.70.9748.7

26.025

1-429.728

26.02525.320.81.934.9857.366.9

226.0264.11.90.240.4632.956.9

2-426.0265.94.40.361.1432.1147.6

327.827

26.02515.51.039.1

3-427.827

26.02512.613.10.833.0061.2214.1

3A29.928

28.1263.10.1849.6

3A-429.928

28.1263.01.90.180.4075.3100.1

Note:1)eachsamplewasanalyzedbySDS-PAGEandgel-scanning,thenmeasuredbyLowrymethod;2)eachsamplewasanalyzedbyimmunoblotandtheresultwasreadbyUVmaxkineticmicroplatereader

表2rS1亞單位的信號肽處理與N-末端序列分析

Tab.2N-terminusofrS1subunitsandsignalprocessing

rS1subunit

N-terminus(band)

%cleavage1)

Sf21Larva

1Nativesignalsequence(upper)

NativeS1subunit(lower)19

1-4Nativesignalsequence(upper)

MutantS1subunit(lower)1716

2NativeS1subunit(single)

2-4MutantS1subunit(single)

3Influenzavirussignalsequence(upper)

NativeS1subunit(lower)63

3-4Influenzavirussignalsequence(upper)

MutantS1subunit(lower)6961

3AInfluenzavirussignalsequence(upper)

NativeS1subunit(lower)65

3A-4Influenzavirussignalsequence(upper)

MutantS1subunit(lower)7381

Note:1)signal-cleavingefficiencywascalculatedbasedonthe3-dimensionvolumeofeachlowerbandandthetotalvolumeofeachrS1subunit(twobands),whichwereobtainedbydensitometerizationoftheWesternblotpatternofeachrS1protein

3討論

PT是百日咳疫苗主要保護性免疫原。傳統(tǒng)百日咳疫苗有較大毒副作用，這可能與PT的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)。曾使用多種化學(xué)試劑對PT進行脫毒，但化學(xué)脫毒法要么不能去除全部酶活性，要么對分子的修飾作用太大，以致破壞了其免疫原性。Burnette等通過單一氨基酸替換(R9→K)技術(shù)構(gòu)建了一種S1變異子［1］，該變異子的酶活性消失，但仍保持其保護性決定簇，這為百日咳疫苗的研制開辟了新途徑。鑒于此我們對天然及變異S1亞單位進行了一系列分子修飾，并實現(xiàn)了這些亞單位在rBV系統(tǒng)中的高水平表達。所有的rS1蛋白均可被抗PT的抗血清和抗S1亞單位的單克隆抗體識別。

Matsuura等應(yīng)用rBV載體表達了一種非成熟的S1亞單位(PTS1，相當(dāng)于本研究中的rS1/1)［8］。在分子量、信號肽處理等方面，本研究與其相似，但表達水平是他們的20～130倍。本研究中所有帶信號肽的rS1/1均為雙帶，表明MW與理論值相比有細(xì)微差別。微量蛋白序列分析證實2種信號序列的表達和切割都是正確的，但均不完全。計算機輔助分析(Wisconsin軟件，結(jié)果未示)表明，rS1分子上沒有潛在的糖基化位點。因此，rS1蛋白的異源性表達是信號肽不完全切割的結(jié)果，而表明MW偏移并不意味著信號肽處理不正確或rS1分子的糖基化。除凝膠掃描(即物理定量法)外，我們還使用免疫斑點試驗(免疫定量法，表1)和ELISA(結(jié)果未示)對rS1的表達量進行了分析。后兩種免疫方法測定結(jié)果很相似，但同凝膠掃描結(jié)果顯著不同。免疫定量法測得的表達量明顯低于物理定量法的結(jié)果，且rS1/1和rS1/1-4的相對含量明顯偏低，而免疫印跡分析(圖2、3)與物理定量法的結(jié)果更相符，因此認(rèn)為rS1亞單位的免疫反應(yīng)性可能受信號肽和樣品處理方式(變性與否)的影響。成熟S1亞單位的N端(1～17或1～18氨基酸殘基)有一個顯性決定簇［1］，rS1/1和rS1/1-4上攜帶的天然信號序列(34個殘基)可能遮蓋此位點。在免疫斑點和ELISA試驗中，樣品未經(jīng)變性處理，因此rS1蛋白的高級結(jié)構(gòu)仍然存在。在免疫印跡分析中，樣品經(jīng)變性處理，故這種遮蓋效應(yīng)連同高級結(jié)構(gòu)將不復(fù)存在。rS1亞單位的生物學(xué)特性及免疫學(xué)特性將通過進一步的研究進行評價。

百日咳毒素S1亞單位的分子修飾及在重組桿狀病毒中的表達本課題受國家自然科學(xué)基金資助(No.39580022)

作者單位：于康震(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱150001)

BurnetteWNKaslowHRMarVLAhmadSYilmaTD(美國加利福尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，Davis,CA95616)

BurnetteWNMarVL美國Amgen公司,ThousandOaks,CA91320

KaslowHR美國南加利福尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院,LosAngeles,CA90033

作者簡介：于康震，男，37歲，研究員，博士生導(dǎo)師；

YilmaTD,男，53歲，教授，博士生導(dǎo)師

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