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【摘要】為了快速鑒定DEL表型，建立浙江漢族del表型的基因分型方法，根據(jù)RHD1227A等位基因序列設(shè)計(jì)等位基因特異性-聚合酶鏈反應(yīng)(allelespecific-polymerasechainreaction,AS-PCR)，用于DEL表型的基因分型。用已知RHD1227A多態(tài)性的樣本和已知DEL表型的樣本評(píng)價(jià)基因分型方法的靈敏度和特異性。結(jié)果表明：在50例RHD1227A陽性和50例RHD1227A陰性的Rh陰性樣本中基因分型方法的靈敏度和特異性都是100％；在33例DEL陽性樣本和89例DEL陰性的樣本中，基因分型方法的靈敏度為100％，有2例樣本血清學(xué)結(jié)果為陰性而基因分型結(jié)果為陽性，重新用血清學(xué)方法和序列分析方法復(fù)核這2例樣本，發(fā)現(xiàn)2例都是血清學(xué)漏檢，因而基因分型方法的特異性是100％。結(jié)論：設(shè)計(jì)的基因分型方法可以有效地鑒定浙江漢族Rh陰性人群中的DEL表型。

【關(guān)鍵詞】DEL表型；RHD1227A等位基因；基因分型

EstablishmentofGenotypingMethodforDELPhenotypeinZhejiangHanPopulation

AbstractInordertoestablishagenotypingmethodforDELphenotypeinZhejiangHanpopulation,anAS-PCRmethodwasdevelopedaccordingtotheRHD1227Aallelesequence.ItsspecificityandsensitivitywereassessedintwoRhnegativepopulationswhoseRHD1227AorDELphenotypestatuswasknown.Theresultsshowedthatinevaluationofthemethodbydetecting50RHD1227Apositiveand50RHD1227Anegativeindividuals,thegenotypingmethoddisplayedasensitivityof100%andaspecificityof100%;inevaluationofthemethodbydetecting33DELpositiveand89DELnegativeindividuals,thesensitivitywas100%,however,thereweretwoserologicallynegativesampleswhichwereconfirmedaspositiveusinggenotypingmethod.Afterre-testingthesetwosampleswithserologicalmethodandsequenceanalysis,itwasfoundthatoriginalserologicalmethodgavefalsenegativeresultsandgenotypingmethodstillshowed100%specificity.TheminimaltargetDNAconcentrationofthisgenotypingmethodis8.13ng/μl.Inconclusion,designedgenotypingmethodcanbeusedtoidentifyDELphenotypeefficientlyinZhejiangHanRhnegativepopulation.

KeywordsDELphenotype;RHD1227Aallele;Genotyping

Rh血型中D抗原在輸血醫(yī)學(xué)和產(chǎn)科學(xué)中意義最為顯著。最近的研究發(fā)現(xiàn)，DEL表型（一種極弱表達(dá)的D抗原，只有通過吸收釋放的方法才能檢測到，稱為DEL抗原）的血液輸注給Rh陰性患者仍會(huì)產(chǎn)生抗D免疫反應(yīng)［1］，因此，對(duì)DEL抗原的免疫原性應(yīng)予以重視［2-4］。目前常用的血清學(xué)DEL表型鑒定方法由于步驟繁瑣而不適合臨床大規(guī)模應(yīng)用，如何快速有效的鑒定DEL表型已成為一個(gè)具有重要臨床意義的課題。我們的研究發(fā)現(xiàn)，浙江漢族DEL表型和RHD1227A相關(guān)（未發(fā)表研究結(jié)果）。根據(jù)RHD1227A等位基因序列，我們設(shè)計(jì)了1種AS-PCR方法，通過檢測100例RHD1227A多態(tài)性已知的Rh陰性樣本和122例DEL表型已知的樣本，對(duì)該方法用于浙江漢族Rh陰性人群中DEL表型基因分型的適用性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

材料和方法

對(duì)象

在浙江省居住或者工作的無親緣關(guān)系Rh陰性漢族獻(xiàn)血員222例，包括50例RHD1227A陽性和50例RHD1227A陰性（參照參考文獻(xiàn)［5］，序列分析確定RHD1227A位點(diǎn)的多態(tài)性）、33例DEL陽性和89例DEL陰性(DEL表型采用氯仿釋放的方法鑒定，見參考文獻(xiàn)［6］)。

Rh表型血清學(xué)鑒定

RhD表型鑒定采用常規(guī)鹽水平板法，使用加拿大Dominion公司的IgM和IgG混合的抗D試劑。RhC、Rhc、RhE和Rhe鑒定采用鹽水試管法，試劑為Dominion公司的相應(yīng)單克隆抗體。

基因分型

根據(jù)RHD基因和RHD1227A等位基因相關(guān)序列設(shè)計(jì)一組特異擴(kuò)增RHD1227A等位基因的引物：RHDEL-s:5''''-GACCAAGTTTTCTGGAAA-3''''（位置對(duì)應(yīng)于AJ299028的68-85）、RHDEL-a:5''''-CGAGAG-AATTTTGAGCAC-3''''（位置對(duì)應(yīng)于AB035185的849-832）。1對(duì)特異擴(kuò)增人生長激素基因429bp的引物作為內(nèi)對(duì)照，HGH-s：5''''-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3'''';HGH-a：5''''-TCACGGATTTCTGTTGTGTTT-3''''。反應(yīng)總體積10μl，含模板DNA0.2μl（約含DNA50-60ng），特異性引物終濃度250nmol/L，內(nèi)對(duì)照引物終濃度50nmol/L，MgCl2終濃度1.5mmol/L，dNTP終濃度200μmol/L，Taq酶0.2U（TaKaRa公司產(chǎn)品）。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5分鐘，然后94℃變性30秒、58℃退火30秒和72℃延伸50秒，循環(huán)30次，最后72℃延伸5分鐘。產(chǎn)物通過2％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀（Syngene公司產(chǎn)品，英國）觀察結(jié)果。

基因分型方法DNA濃度檢測下限評(píng)估

將RHD1227A陽性的DNA用BioPhotometer（Eppendorf公司產(chǎn)品，德國）測得濃度，用RHD1227A陰性的DNA作為稀釋液，倍比稀釋RHD1227A陽性樣本。稀釋后DNA的PCR產(chǎn)物通過2％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀（Syngene公司產(chǎn)品，英國）觀察結(jié)果。

結(jié)果

RHD1227A多態(tài)性已知的Rh陰性人群

在100例Rh陰性人群中，用基因分型方法擴(kuò)增50例RHD1227A陽性樣本，都可擴(kuò)增得到867bp的特異條帶和429bp的內(nèi)對(duì)照條帶，即結(jié)果都為陽性；擴(kuò)增50例RHD1227A陰性樣本，都只能擴(kuò)增出429bp的內(nèi)對(duì)照條帶，即結(jié)果都為陰性。這表明基因分型方法在該群體中檢測RHD1227A的靈敏度和特異性都為100％。電泳圖見圖1。

DEL表型已知人群的Rh陰性人群

在122例DEL表型已知的人群中，用基因分型方法擴(kuò)增33例DEL表型陽性樣本，結(jié)果都為陽性，擴(kuò)增89例DEL表型陰性樣本，結(jié)果有2例（RhCedee）為陽性，87例為陰性。用原始的DEL表型鑒定結(jié)果做參照，基因分型方法在該群體中檢測DEL表型的靈敏度為100％，特異性為97.75％。

血清學(xué)方法和基因分型方法結(jié)果不一致樣本

對(duì)DEL表型血清學(xué)方法檢測結(jié)果為陰性、基因分型檢測結(jié)果為陽性的2例樣本重新取樣分析。血清學(xué)吸收釋放結(jié)果為DEL陽性，外顯子9序列分析結(jié)果為RHD1227A為陽性。即2例樣本的基因分型結(jié)果和血清學(xué)結(jié)果不符是由于原始血清學(xué)方法的漏檢DEL表型造成。因此，基因分型方法的特異性仍然為100％。

基因分型方法的DNA濃度檢測下限

將RHD1227A陽性的DNA用RHD1227A陰性的DNA倍比稀釋后，3份樣本都可以在稀釋32倍后，仍然可以擴(kuò)增到比較清楚的陽性條帶（圖2）。稀釋64倍的樣本擴(kuò)增結(jié)果不可見。3份樣本原始DNA濃度分別為290ng/μl、250ng/μl和240ng/μl，取算術(shù)平均值260ng/μl?；蚍中头椒ǖ腄NA濃度檢測下限以稀釋32倍計(jì)算，約為8.13ng/μl。

討論

亞洲Rh陰性人群有很高比例的DEL表型，并且各地DEL表型的分子機(jī)理不盡一致［7-12］。中國臺(tái)灣人群DEL分子機(jī)制主要有外顯子9缺失和RHD1227A等位基因2種［7-10］。中國深圳人群DEL的分子機(jī)制主要由RHD1227A等位基因引起，和3''''非翻譯序列無關(guān)［11-12］。我們未發(fā)表的研究結(jié)果表明,浙江漢族人群DEL分子機(jī)制也是由RHD1227A等位基因引起。因此，我們根據(jù)RHD1227A等位基因序列設(shè)計(jì)了AS-PCR方法用于DEL表型的基因分型檢測。通過檢測100例RHD1227A多態(tài)性已知的Rh陰性樣本，我們證明該基因分型方法可以有效的檢測RHD1227A等位基因，并且該方法的DNA濃度檢測下限約為8.13ng/μl，對(duì)Rhccdee等DEL表型陽性概率比較低的樣本可以通過檢測5-10份樣品的混合樣來提高工作效率。檢測122例DEL表型已知的樣本發(fā)現(xiàn)，基因分型結(jié)果和原來的血清學(xué)DEL表型結(jié)果有2例不一致。重新取樣做血清學(xué)鑒定和序列分析發(fā)現(xiàn)，這2例基因分型結(jié)果陽性、血清學(xué)結(jié)果陰性樣本是由于血清學(xué)方法的漏檢造成。血清學(xué)漏檢DEL表型可能與不同批號(hào)抗D試劑的效價(jià)、血樣的新鮮程度、抗人球蛋白試劑的效價(jià)和靈敏度以及吸收釋放操作步驟標(biāo)準(zhǔn)化程度等眾多因素有關(guān)，這也提示基因分型方法比血清學(xué)DEL鑒定方法靈敏度更高，重復(fù)性更好。另外，基因分型方法還可以利用血站的核酸檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測?；蚍中偷撵`敏度和特異性在我們的研究樣本中都為100％，表明該法可以用于檢測浙江漢族Rh陰性人群中的DEL表型。據(jù)我們所知，國內(nèi)尚未有DEL表型基因分型方法的報(bào)道。用我們的基因分型方法可以簡便地在Rh陰性人群中鑒定DEL表型，便于將來系統(tǒng)研究DEL抗原的免疫原性，從而更安全的使用DEL血液。

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