導(dǎo)語(yǔ)：鱟抗脂多糖因子對(duì)晚期炎癥研究一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

作者：吳林青,許偉群,張秋玉,胡海霞,祝先進(jìn),蘇東輝

【摘要】目的觀察鱟抗脂多糖因子(LALF)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞晚期炎癥因子高遷移率族蛋白1(HMGB1)功能的拮抗效應(yīng),探討LALF對(duì)晚期內(nèi)毒素血癥動(dòng)物的保護(hù)機(jī)制。方法用HMGB1刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,加入或不加LALF,遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞趨化作用,ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子(TNF)α濃度。結(jié)果巨噬細(xì)胞遷移指數(shù)的增加呈HMGB1劑量依賴性,HMGB1刺激后巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNFα濃度顯著增高。LALF與HMGB1預(yù)混合顯著降低巨噬細(xì)胞的遷移指數(shù)和培養(yǎng)上清液TNFα濃度。結(jié)論LALF可能通過(guò)抑制HMGB1而發(fā)揮其對(duì)晚期膿毒癥動(dòng)物的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】高遷移率族蛋白;膿毒癥;鱟抗脂多糖因子；趨化作用

ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectsoflimulusantilipopolysaccharidefactor(LALF)onthelateproinflammatorycytokineofhighmobilitygroupbox1(HMGB1).MethodsTheprimarymousemacrophageswereculturedandstimulatedbyHMGB1.Macrophagemigrationwasdeterminedbytheuseofchemotaxischamber.ELISAquantitatedtheculturesupernatantsforTNFαproduction.LALFwasaddedtoexploretheeffectsofHMGBIandTNFαproductioninculture.ResultsThechemotacticindexofmacrophagesandtheconcentrationofTNFαintheculturesupernatantsevidentlyincreasedindosedependentmannerinHMGB1groupsandprominentlydecreasedbytheLALFcoincubated.ConclusionHMGB1wasfirstlyindicatedinthisstudytobedirectlyinhibitedbyLALFinlatecourseofendotoxemia.

KEYWORDS:highmobilitygroupproteins;sepsis;macrophage;horseshoecrabs;lipopolysaccharides;tumornecrosisfactoralpha;inflammation

膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房病人常見(jiàn)的死因。腫瘤壞死因子(TNF)α、白細(xì)胞介素(IL)1等促炎癥因子曾被普遍認(rèn)為是引起膿毒癥死亡的“核心因子”[1],以往認(rèn)為在這些促炎癥因子達(dá)峰以后再給予抗內(nèi)毒素的治療難以逆轉(zhuǎn)膿毒癥的病程。具有重要意義的是,Levin實(shí)驗(yàn)室給致死量細(xì)菌內(nèi)毒素即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)攻擊后4，10h甚至24h的Swiss小鼠注射天然鱟抗脂多糖因子(limulusantilipopolysaccharidefactor,LALF)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物晚期膿毒癥的有效保護(hù)[2],提示LALF可能對(duì)促炎癥因子消退后的某個(gè)或某些晚期介質(zhì)起拮抗作用。1999年,Wang等發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白1(highmobilitygroupbox1,HMGB1或HMG1)是膿毒癥致死性全身反應(yīng)的一種重要的晚期促炎性因子[3]。本研究以體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,觀察LALF對(duì)HMGB1部分生物學(xué)活性的影響,探討LALF對(duì)膿毒癥晚期的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物昆明種小鼠,雄性,體質(zhì)量20～25g[福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)scxk(閩)20050003]。飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料,隨意飲水。

1.1.2主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基、PBS平衡鹽溶液(美國(guó)Hyclone公司)。E.coliO55:B5LPS、重組HMG1(美國(guó)Sigma公司)。48孔微遷移板(AP48,美國(guó)NeuroProbe公司)。TNFαELISA試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)。LALF（美國(guó)麻薩諸塞州Woodhole海洋生物實(shí)驗(yàn)室Wainright博士惠贈(zèng)）。大鼠抗小鼠TLR2(IgG)FITC及正常大鼠IgGFITC(美國(guó)SantaCruz公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備頸椎脫臼處死小鼠,以PBS腹腔灌洗法收集腹腔巨噬細(xì)胞懸液,1500r/min(4℃)離心10min,棄上清,洗滌1次,用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106mL-1,根據(jù)需要接種于24孔(1mL/孔)或6孔(2mL/孔)細(xì)胞培養(yǎng)板中,置37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后去除未貼壁細(xì)胞換液繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2.2趨化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[45]方法。將含不同濃度HMGB1的無(wú)血清培養(yǎng)液25μL加入下室,同時(shí)以細(xì)胞稀釋液作為陰性對(duì)照。另一組在趨化板下室的細(xì)胞中加入不同濃度LALF與HMGB1預(yù)混合培養(yǎng)液,同時(shí)設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)液、單獨(dú)LALF和單獨(dú)HMGB1對(duì)照組。再將1片5μm孔徑的聚碳酸酯膜覆蓋在小室上,最后將巨噬細(xì)胞(1×106mL-1)50μL加入到上室中,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育90min。孵育后聚碳酸酯膜用甲醇固定并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。在光學(xué)顯微鏡下用高倍鏡計(jì)數(shù)5個(gè)視野下的遷移細(xì)胞數(shù),結(jié)果用遷移指數(shù)表示:

遷移指數(shù)＝試驗(yàn)組遷移的細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組遷移的細(xì)胞數(shù)

一式3份,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液的TNFα濃度小鼠腹腔巨噬細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,在不同時(shí)間加入含1μg/mLHMGB1的培養(yǎng)液,設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)液的對(duì)照組。另一組細(xì)胞加入不同濃度LALF與HMGB11μg/mL預(yù)混合培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)8h,設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)液、單獨(dú)LALF、單獨(dú)HMGB1的對(duì)照組。吸取培養(yǎng)上清,用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)TNFα含量,操作方法按說(shuō)明書進(jìn)行。一式3份,重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,組間差異以單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn),P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1LALF對(duì)HMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化作用的影響

2.1.1HMGB1對(duì)巨噬細(xì)胞趨化作用的誘導(dǎo)HMGB1顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的遷移指數(shù),其峰值所對(duì)應(yīng)的HMGB1濃度為1μg/mL。在0.1～1μg/mL濃度區(qū)間,HMGB1的效應(yīng)呈劑量依賴性(圖1)。

HMGB1:晚期炎癥因子高遷移率族蛋白1.與HMGB10μg/mL對(duì)照組比較,☆:P<0.01.

圖1不同濃度HMGB1對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的作用（略）

Fig1EffectofHMGB1onmacrophagemigration

2.1.2LALF對(duì)HMGB1誘導(dǎo)趨化作用的影響不同濃度LALF(5,10,15μg/mL)與1μg/mLHMGB1預(yù)混合巨噬細(xì)胞遷移試驗(yàn)顯示,LALF顯著降低巨噬細(xì)胞的遷移指數(shù),這種抑制效應(yīng)呈LALF劑量依賴性。單獨(dú)LALF對(duì)巨噬細(xì)胞的遷移指數(shù)無(wú)影響(圖2)。

2.2LALF對(duì)HMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNFα的影響

2.2.1HMGB1對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TNFα的誘導(dǎo)對(duì)照組單獨(dú)使用培養(yǎng)液刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNFα(35±5)pg/mL。加入1μg/mLHMGB14,8,24h測(cè)定值分別為(725±35),(839±30),(586±40)pg/mL,各組與對(duì)照組比較,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A:單獨(dú)培養(yǎng)液;B:LALF15μg/mL;C:HMGB11μg/mL;D:HMGB11μg/mL+LALF5μg/mL;E:HMGB11μg/mL+LALF10μg/mL;F:HMGB11μg/mL+LALF15μg/mL.與C組比較,☆:P<0.05,☆☆:P<0.01.

圖2LALF對(duì)HMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移作用的影響（略）

Fig2RoleofLALFonmacrophagemigrationinducedbyHMGB1

2.2.2LALF對(duì)HMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNFα的影響LALF(5,10,15μg/mL)與1μg/mLHMGB1預(yù)混合后可劑量依賴性地降低TNFα的釋放,與單獨(dú)HMGB1的對(duì)照組比較,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。單獨(dú)培養(yǎng)液和單純LALF刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNFα量極低(圖3)。

HMGB1:晚期炎癥因子高遷移率族蛋白1.TNFα：腫瘤壞死因子α.A:單獨(dú)培養(yǎng)液;B:LALF15μg/mL;C:HMGB11μg/mL;D:HMGB11μg/mL+LALF5μg/mL;E:HMGB11μg/mL+LALF10μg/mL;F:HMGB11μg/mL+LALF15μg/mL.與C組比較,☆:P<0.01.

圖3LALF對(duì)HMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNFα的影響（略）

Fig3EffectofLALFonTNFαsecretioninducedbyHMGB1

3討論

3.1LALF對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物晚期膿毒癥的保護(hù)作用膿毒癥指的是由感染引起的全身炎癥反應(yīng),LPS等成分刺激免疫細(xì)胞釋放過(guò)量的炎癥因子是膿毒癥死亡的主要原因[6]。鱟抗脂多糖因子是從北美馬蹄蟹(美洲鱟)變形細(xì)胞提取純化的一種蛋白質(zhì),已知它具有中和內(nèi)毒素的作用,因此稱為內(nèi)毒素中和蛋白。資料顯示,經(jīng)典的促炎癥因子TNFα和IL1等在LPS攻擊后1～3h達(dá)峰并迅速衰減,6h基本回落至正常水平[7]。動(dòng)力學(xué)研究也表明,在腹腔注射LPS后24h時(shí)TNFα血漿濃度下降到峰值的1/10[8]。在促炎癥因子消退后給予LALF顯然對(duì)已知促炎癥因子的產(chǎn)生及其直接效應(yīng)不起對(duì)抗作用。因此有理由推測(cè)除了具有中和內(nèi)毒素的活性外LALF可能對(duì)某種或某些晚期介質(zhì)、凝血系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)等的產(chǎn)生和效應(yīng)起拮抗作用。

3.2HMGB1對(duì)內(nèi)毒素致死性的晚期介質(zhì)作用HMGB1是一種相對(duì)分子質(zhì)量30kD的蛋白,長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)其認(rèn)識(shí)主要局限于它是一種DNA結(jié)合蛋白,起著維持核小體結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的作用。由于其介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的效應(yīng)不斷被發(fā)現(xiàn),現(xiàn)在許多學(xué)者已經(jīng)將HMGB1作為一個(gè)特殊成員歸屬于促炎性細(xì)胞因子。與經(jīng)典的促炎癥因子相比,HMGB1具有分泌晚、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn),因而被界定為晚期炎癥介質(zhì)。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)HMGB1在膿毒癥休克中的重要性：(1)膿毒癥動(dòng)物模型、感染及膿毒癥引起的器官功能障礙的病人血清中HMGB1水平明顯升高[9]。(2)給小鼠注射重組HMGB1,出現(xiàn)膿毒癥的典型臨床癥狀,包括發(fā)熱、不適、腸上皮屏障功能紊亂以及多器官功能障礙等[10]。(3)給予HMGB1抗體能有效預(yù)防膿毒癥的發(fā)生,甚至逆轉(zhuǎn)膿毒癥的病理過(guò)程[11]。

3.3LALF對(duì)HMGB1體外效應(yīng)的拮抗作用巨噬細(xì)胞是白細(xì)胞中功能最為活躍的細(xì)胞之一,對(duì)內(nèi)毒素具有強(qiáng)烈的反應(yīng)性,是機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的主要細(xì)胞。膿毒癥時(shí),LPS及TNFα均可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌晚期介質(zhì)HMGB1。本研究用體外實(shí)驗(yàn)顯示,HMGB1可進(jìn)一步反作用于巨噬細(xì)胞引起TNFα分泌,構(gòu)成了炎癥因子間的正反饋調(diào)節(jié),擴(kuò)大和促進(jìn)了炎癥反應(yīng)。大量研究已經(jīng)證實(shí),HMGB1是引起死亡的晚期介質(zhì),在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中具有重要作用?？梢栽O(shè)想,體內(nèi)HMGB1促進(jìn)炎癥細(xì)胞的趨化作用可能是動(dòng)物死亡的重要原因之一。同樣,推想LALF控制晚期炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制可能在于LALF對(duì)HMGB1這一致死性介質(zhì)的效應(yīng)具有抑制作用,表現(xiàn)為L(zhǎng)ALF可抑制HMGB1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的趨化作用,以及HMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNFα等,從而產(chǎn)生對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)作用。這些推想有待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)LALF可在體外抑制HMGB1的效應(yīng),提示其在動(dòng)物晚期膿毒癥中的保護(hù)作用的一個(gè)可能的機(jī)制。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)、研究LALF在調(diào)節(jié)免疫防御方面的功能提供了啟發(fā),同時(shí)也可能為細(xì)菌感染時(shí)調(diào)節(jié)天然免疫和炎癥反應(yīng)提供了新的治療策略。

(鳴謝:美國(guó)馬薩諸塞州Woodhole海洋生物實(shí)驗(yàn)室Wainright博士惠贈(zèng)本實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵試劑LALF,舊金山加州大學(xué)Levin博士對(duì)本課題的指導(dǎo)與支持。)

【參考文獻(xiàn)】

[1]KarimaR,MatsumotoS,HigashiH,etal.Themolecularpathogenesisofendotoxicshockandorganfailure[J].MolMedToday,1999,5(3):123132.

[2]RothRI,SuDH,ChildAH,etal.Limulusantilipopolysaccharidefactor(LALF)presentsmortalitylateinthecourseofendotoxemia[J].JInfectDis,1998,177(2):388394.

[3]WangHC,BloomO,ZhangM,etal.HMG1asalatemediatorofendotoxinlethalityinmice[J].Science,1999,285(5425):248251.

[4]YangD,ChenQ,YangH,etal.Highmobilitygroupbox1proteininducesthemigrationandactivationofhumandendriticcellsandactsasanalarmin[J].JLeukocBiol,2007,81(1):5966.

[5]DumitriuIE,BianchiME,BacciM,etal.ThesecretionofHMGB1isrequiredforthemigrationofmaturingdendriticcells[J].JLeukocBiol,2007,81(1):8491.

[6]RiedemannNC,GuoRF,WardPA.Novelstrategiesforthetreatmentofsepsis[J].NatMed,2003,9(5):517524.

[7]SuD,RothRI,LevinJ.Hemoglobininfusionaugmentsthetumornecrosisfactorresponsetobacterialendotoxin(lipopolysaccharide)inmice[J].CritCareMed,1999,27(4):771778.

[8]JuDW,ZhengQY,CaoX,etal.Esculentosideainhibitstumornecrosisfactorinterleukin1andinterleukin6productioninducedbylipopolysaccharideinmice[J].Pharmacology,1998,56(4):187190.

[9]WangH,LiW,LiJ,etal.Theaqueousextractofapopularherbalnutrientsupplement,angelicasinensis,protectsmiceagainstlethalendotoxemiaandsepsis[J].JNutr,2006,136(2):360365.

[10]LiJ,KokkolaR,TabibzadihS,etal.Structuralbasisfortheproinflammatorycytokineactivityofhighmobilitygroupbox1[J].MolMed,2003,9(12):3745.

[11]ChenG,LiJ,QiangX,etal.SuppressionofHMGB1releasebystearoyllysophosphatidylcholine:anadditionalmechanismforitstherapeuticeffectsinexperimentalsepsis[J].JLipidRes,2005,46(4):623627.