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作者：李娜,吳麗賢,溫彩霞,黃秀旺,許建華

【摘要】目的研究姜黃素衍生物Fm04對K562細(xì)胞的增殖及對P210bcr/abl信號通路的影響。方法應(yīng)用MTT法檢測姜黃素衍生物Fm04對K562細(xì)胞增殖的影響;應(yīng)用Westernblot法檢測P210bcr/abl及其下游通路蛋白表達(dá)的變化和線粒體細(xì)胞色素C的變化;比色法測定Caspase3、Caspase9活化程度。結(jié)果Fm04對K562細(xì)胞的抑制作用呈量效、時效關(guān)系,4μmol/LFm04作用24h,抑制率88.4%,半數(shù)抑制濃度1.45μmol/L,強(qiáng)度約為姜黃素的7倍;Westernblot表明Fm04可顯著下調(diào)P210bcr/abl及其下游信號通路蛋白,減少細(xì)胞線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C含量;Fm04處理組Caspase3、Caspase9濃度值增加。結(jié)論Fm04顯著抑制k562細(xì)胞的增殖并減少P210的蛋白含量從而下調(diào)P210bcr/abl下游多種信號分子表達(dá),通過激活caspase的活化和線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放,最終誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡。

【關(guān)鍵詞】姜黃素;細(xì)胞凋亡;白血病,髓樣,慢性;融和蛋白質(zhì)類;bcrabl;K562細(xì)胞;信號傳導(dǎo)

ABSTRACT:ObjectiveTostudytheapoptosisinducingeffectsofthesyntheticalcurcuminderivativeFm04onchronicmyelogenousleukemia(CML)cell.MethodsMTTwasusedtodeterminetheapoptoticeffectsofFm04onK562cells.ThesignalproteinmoleculesexpressedinK562cellswasexaminedbyWesternBlotting.ThespectrophotometerkitwasusedtodetecttheactivityofCaspase3andCaspase9.ResultsExposureofK562cellstoFm04producedbothconcentrationandtimedependentincreaseintheantiproliferativerate.K562cellsweremuchmoresensitivetofm04thantocurcumin,4μmoL/LFm04for24htheinhibitingratsreached88.4%andtheIC50ofFm04was1.45μmol/L.Moreover,thelevelofP2l0bcr/ablaswellasthedownstreamsignalproteinwasstronglydownregulatedinfm04treatedK562cells,andtheDvalueofCaspase3andCaspase9wasupregulatedinFm04treatedK562cells.ConclusionFm04exhibitsstrongeractivityininducingapoptosisinchronicmyelogenousleukemia(CML)cellsthancurcuminbyhavingstrongeractivityofthedownregulationoftheP2l0bcr/ablandotherproteins,andbyactivingthecaspasecascadesandinducingthestrongerreleaseofcytochromeCfrommitochondria.Fm04mightbeworthyofbeingconsideredasapotentialchemotherapeuticagentofCML.

KEYWORDS:curcuminderivative;apoptosis;leukemia;P210bcr/abl

姜黃素(curcumin,Cur)系從姜黃中提取的酚性有效單體化合物,具有抗腫瘤、抗氧化、抗突變、抗炎、抗血小板聚集等廣泛的藥理作用[1]。近年來,有關(guān)姜黃素的藥理學(xué)研究尤其在抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面的作用日益受到重視，并發(fā)現(xiàn)Cur與STI571體外聯(lián)合應(yīng)用可明顯協(xié)同下調(diào)P210bcr/ab1的表達(dá)水平，這對于降低慢性粒細(xì)胞白血病對STI571的耐藥性的一定的意義[2]。但姜黃素水溶性差,水溶液易水解,首過消除現(xiàn)象明顯,生物利用度低,成為限制其臨床應(yīng)用的主要因素和產(chǎn)業(yè)化的瓶頸[3]。本實驗保留分子中共扼β二酮鏈等活性必需基團(tuán),設(shè)計合成新的姜黃素衍生物Fm04。

P210bcr/abl融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),依靠Bcr的雙聚體區(qū),以形成二聚體。P210bcr/abl蛋白可通過其酪氨酸激酶(PTK)的持續(xù)激活而活化下游相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,包括Ras/MAPK、PI3K、Erk、NFκB、JakSTAT通路等[49],并阻斷線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C(CytC)的釋放引起caspases級聯(lián)的激活[10],從而阻止細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖,是治療慢性粒細(xì)胞白血病的分子靶點。筆者以K562細(xì)胞為模型,對新合成姜黃素衍生物Fm04的體外抗慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞活性進(jìn)行初步評價及探討。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑姜黃素(上海試劑三廠,批號980825),純度99%;姜黃素衍生物Fm04由本實驗室合成并提純,經(jīng)核磁共振光譜驗證,經(jīng)HPLC及薄層層析分析鑒定,純度>90%;Westernblot試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司];抗ABL單克隆抗體、Erk1/2、pErk、AKT、pAKT、CytC、NFκB(P65)、βactin抗體(美國SantaCruz公司);Caspase3、Caspase9分光光度法檢測試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司)。

1.1.2細(xì)胞株及培養(yǎng)條件人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562(中科院上海細(xì)胞研究所),培養(yǎng)于含10%新生牛血清,1×108U/L青霉素及100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液,在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞接種24h后進(jìn)入指數(shù)增長期。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞增殖采用MTT法,觀察Fm04對K562細(xì)胞作用的量效與時效關(guān)系,接種指數(shù)生長期的K562細(xì)胞于96孔板上,分別設(shè)置空白組,Fm04組（1,2,4,8μmol/L）,Cur組（5,10,20,40μmol/L）。將培養(yǎng)板置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至所需的時間,加入MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,離心,棄上清,加入DMSO,顆粒完全溶解后用酶標(biāo)儀在570nm處測定每孔的光密度值(D)。

1.2.2P210bcr/abl等信號蛋白表達(dá)采用Westernblot法,藥物處理細(xì)胞24h,收集細(xì)胞,以0.01mol/L浴冷PBS(pH7.2)洗2次,加入去污裂解緩沖液于4℃裂解30min,離心,吸出上清,即為細(xì)胞總蛋白,用BCA蛋白定量,各組均采用同樣的蛋白量上樣,在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜,封閉液封閉過夜,加一抗室溫作用1h,洗去未結(jié)合的一抗,以Westernblot試劑盒加二抗,DAB染色。

1.2.3Caspase3和Caspase9活性藥物處理細(xì)胞24h,收集細(xì)胞,采用Caspase3、Caspase9分光光度法檢測試劑盒,用分光光度計在λ=405nm測定其D值。通過計算D誘導(dǎo)劑/D陰性對照的倍數(shù)來確定Caspase3和Caspase9活化程度。

2結(jié)果

2.1Fm04對K562細(xì)胞增殖的抑制K562細(xì)胞增殖抑制率隨Fm04濃度增大而提高,呈劑量依賴關(guān)系(圖1A),其IC50為1.45μmol/L,強(qiáng)度約為姜黃素的7倍;K562細(xì)胞增殖抑制率隨著Fm04作用時間的延長而提高,呈時間依賴關(guān)系(圖1B),且低濃度Fm04在12,24及48h對K562細(xì)胞抑制率均比高濃度姜黃素高。

A:不同濃度Fm04和Cur;B:Fm044μmol/L和Cur10μmol/L.

圖1Fm04對K562細(xì)胞增殖抑制的影響（略）

Fig1InhibitoryeffectofFm04onproliferationofK562cells福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報2008年5月第42卷第3期李娜等：姜黃素衍生物Fm04抑制K562細(xì)胞增殖及其對P210bcr/abl信號通路的影響

2.2Fm04對K562細(xì)胞中P210bcr/abl及其下游信號通路蛋白的影響

2.2.1Fm04下調(diào)K562細(xì)胞P210bcr/abl蛋白含量隨Fm04劑量增大,P210bcr/abl蛋白條帶灰度逐漸變淡,Fm041μmol/L就可下調(diào)P210bcr/abl蛋白,Fm044μmol/L最明顯,條帶基本消失,呈量效關(guān)系(圖2A)。Fm044μmol/L作用12h即對p210bcr/abl蛋白有抑制作用,隨著時間的延長,條帶逐漸變淡,至48h,P210bcr/abl蛋白條帶幾乎消失，可見明顯的時效關(guān)系(圖2B)。

A:Fm04;B:4μmol/LFm04.

圖2Fm04對K562細(xì)胞P210bcr/abl蛋白含量的影響（略）

Fig2EffectofFm04onP210bcr/ablinK562cells

2.2.2Fm04對K562細(xì)胞P210bcr/abl下游相關(guān)信號通路蛋白含量的影響分別以Fm041,2,4μmol/L處理K562細(xì)胞12h,隨著劑量增加,NFκB蛋白逐漸減少;而以Fm041,2,4μmol/L處理K562細(xì)胞24h,對于PAKT來說,隨劑量增加,其蛋白含量減少;而對于PErk來說,其蛋白含量隨劑量增加而增加(圖3A)。用Fm044μmol/L分別處理K562細(xì)胞1,3,6,12,24,48h,PErk蛋白含量在1～6h。隨時間延長而減少,處理6h蛋白基本消失,而12～48h,蛋白含量隨著時間延長而逐漸增加,此現(xiàn)象于姜黃素并未發(fā)生。Cur40μmol/L處理K562細(xì)胞,0～48h內(nèi),PErk蛋白含量隨時間變化逐漸減少(圖3B)。

2.3Fm04對線粒體凋亡途徑的影響

2.3.1Fm04觸發(fā)K562細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C釋放Fm041,2,4μmol/L處理K562細(xì)胞24h能促進(jìn)K562細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C釋放,細(xì)胞質(zhì)S100中的含量逐漸增加,相反,線粒體中的細(xì)胞色素C含量逐漸減少(圖4)。

2.3.2Fm04活化Caspase3、Caspase9Fm041,2,4μmol/L處理K562細(xì)胞24h后,Caspase3、Caspase9的活化程度增高,能將偶聯(lián)有發(fā)色基團(tuán)的Caspase3序列特異性的多肽底物被剪切,發(fā)色基團(tuán)游離出來,D值升高。

3討論

3.1Fm04下調(diào)K562細(xì)胞P210bcr/abl及其下游相關(guān)信號通路蛋白含量本實驗合成的姜黃素衍生物Fm04,化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNMR和13CNMR確證。細(xì)胞增殖抑制實驗表明，F(xiàn)m04對K562細(xì)胞有明顯的抑制作用,呈量效和時效關(guān)系,其抑制活性明顯優(yōu)于姜黃素。P210bcr/abl是CML的特征性蛋白,具有異?；钴S的酪氨酸激酶活性,是CML發(fā)病的主要原因,并與其對多種化療藥物耐藥有關(guān),且由于P210bcr/abl含有磷酸化位點,可與含SH2的信號分子相結(jié)合,從而活化下游相關(guān)的多條信號途徑[49],促進(jìn)細(xì)胞增殖。從實驗結(jié)果表明,新合成姜黃素衍生物Fm04可下調(diào)K562細(xì)胞P210bcr/abl含量并呈量效和時效關(guān)系;Fm04還可下調(diào)與K562細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的P210bcr/abl下游信號分子pErk(如6h)、pAKT、NFκB。

A:不同劑量Fm04;B:不同時間Fm04及Cur.

圖3Fm04對K562細(xì)胞P210bcr/abl下游相關(guān)信號分子的影響（略）

Fig3EffectofFm04onthebcr/ablrelatedsignalingmoleculesinK562cells

圖4Fm04對K562細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C(CytC)的影響（略）

Fig4EffectofFm04oncytochromeCofmitochondriainK562cells

圖5Fm04對K562細(xì)胞Caspase3和Caspase9活化程度的影響（略）

Fig5EffectofFm04onactivationofCaspase3andCaspase9inK562cells

3.2Fm04對K562細(xì)胞PErk的影響細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)分為ERK1和ERK2,統(tǒng)稱為ERK1/2,主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫等磷酸化而激活,進(jìn)入細(xì)胞核作用于E1k1,cmyc,cfos,cjun,ATF,NFκB和AP1等轉(zhuǎn)錄因子,促進(jìn)某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),和細(xì)胞的增殖與分化密切相關(guān)。本實驗結(jié)果表明,Fm04作用K562細(xì)胞24h,pErk蛋白含量隨Fm04劑量增大而增加(圖3A),而細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示(圖1)Fm04對K562細(xì)胞的增殖有很強(qiáng)的抑制作用,通過觀察不同時間點Fm04對pErk蛋白表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn),Fm04作用于K562,早期引起pErk減少,而晚期引起其增多,Chunrong等發(fā)現(xiàn)Sti571作用于bcr/abl陽性細(xì)胞也有類似狀況[11]。有報道顯示,細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2是Ca2+/CaM信號通路的重要調(diào)節(jié)因素[1213],許多Ca2+/CaM抑制劑均可引起(ERK)1/2的持續(xù)磷酸化并抑制細(xì)胞增殖。Shim合成研究的姜黃素衍生物HBC可通過引起HCT15細(xì)胞(ERK)1/2的持續(xù)磷酸化而阻斷Ca2+/CaM信號通路而抑制細(xì)胞增殖[14],因此可推斷Fm04除了P210bcr/abl信號通路,或許對Ca2+/CaM信號通路也有一定的抑制作用,該方面機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.3Fm04對K562細(xì)胞Caspase3和Caspase9的影響Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,Caspase9是級聯(lián)酶的上游分子,在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于細(xì)胞漿中,沒有活性,可被從線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放的細(xì)胞色素C激活。Caspase3在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于細(xì)胞漿中,沒有活性;但在細(xì)胞發(fā)生凋亡階段,它被激活,活化的Caspase3由兩個大亞基和兩個小亞基組成,裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Fm04可促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放放入細(xì)胞質(zhì),活化Caspase9和Caspase3,激活下游的凋亡通路。

筆者認(rèn)為,新合成姜黃素衍生物Fm04可顯著抑制K562細(xì)胞增殖并下調(diào)P210bcr/abl信號通路,具有顯著的體外抗慢性粒細(xì)胞白血病活性,筆者將進(jìn)行進(jìn)一步的在體實驗,為進(jìn)一步改造開發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。

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