導(dǎo)語：層黏連蛋白α1、α2、α3、α5亞基研究一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的探討層黏連蛋白（laminin，LN）α1，α2，α3，α5亞基在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特征。方法采用免疫組織化學(xué)SP法和圖像分析技術(shù)分析77例腦膠質(zhì)瘤、8例正常腦組織以及10例腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本中LNα1、α2、α3、α5亞基的表達(dá)情況。結(jié)果（1）人腦膠質(zhì)瘤中，LNα2，α3呈陰性，LNα1，α5陽性染色位于瘤細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，其陽性染色強(qiáng)度與病理級(jí)別密切相關(guān)（P<0.01）；（2）LNα5在血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜呈陽性染色，染色強(qiáng)度與病理級(jí)別比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但明顯強(qiáng)于腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤（P<0.05），后者常表現(xiàn)為基膜不連續(xù)弱陽性染色。結(jié)論（1）LNα1，α5亞基的表達(dá)強(qiáng)度與腦膠質(zhì)瘤病理級(jí)別密切相關(guān)；（2）LNα5在腦膠質(zhì)瘤和腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜表達(dá)的差異可能與瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】腦腫瘤神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤轉(zhuǎn)移層粘連蛋白免疫組織化學(xué)

ABSTRACT:ObjectiveToexploreexpressionpatternsoflamininα1、α2、α3、α5subunitinthehumanbrainglioma.MethodsTheexpressionoflamininα1、α2、α3、α5subunitin77brainglioma,8normalbraintissueand10metastatictumorspecimenswereanalyzedbyimmunohistochemistryandimageanalysistechnique.Results1.Therewerenegativeexpressionoflamininα2、α3subunitandpositiveexpressionoflamininα1、α5subunitinthehumanbraingliomas,whosepositivestaininglocatedintumourcellmembrane,plasma.Thepositivestainingintensitywascorrelatedwithpathologicalgradeofglioma（P<0.001）.2.Therewerealsopositiveexpressionoflamininα5subunitinbloodvesselendothelialcellsandbasalmembrane,whichintensitywasnotcorrelatedwithpathologicalgradeofglioma(P>0.05),butwasstrongerthanexpressioninmetastatictumor(P<0.05).Conclusion1.Theexpressionintensityoflamininα1、α5subunitintumorcellswascloselycorrelatedwithpathologicalgradeofglioma.2.Theexpressiondifferenceoflamininα5subunitinbraingliomaandmetastatictumorwasprobablycorrelatedwiththemetabasisbehavioroftumorcells.

KEYWORDS:brainneoplasms;glioma;neoplasmmetastasis;laminin;immunohistochemistry

福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2008年7月第42卷第4期梅文忠等：層黏連蛋白α1、α2、α3、α5亞基在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)層黏連蛋白（laminin，LN）是一族具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)糖蛋白，它們參與基底膜構(gòu)建，對(duì)維持基底膜的完整結(jié)構(gòu)起重要作用，還在細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)、遷移中扮演著至關(guān)重要的角色[1]。研究表明，某些LN分子在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)增高，且與腫瘤病理級(jí)別相關(guān)，參與膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)而罕見顱外轉(zhuǎn)移行為的調(diào)控[23],但是以往的研究多是針對(duì)LN蛋白分子或某些LN亞型分子的研究，如LN5，LN8，LN9，LN10/11等。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)LNα1，α2，α3，α5亞基在不同病理級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，探討其與人腦膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的關(guān)系。

1材料和方法

1.1材料

手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本77例，其中星形細(xì)胞瘤41例、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤7例、混合型膠質(zhì)細(xì)胞瘤10例、室管膜瘤9例、髓母細(xì)胞瘤3例、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤7例。77例中，男性49例、女性28例，年齡（35±5.9）歲（3～70歲）。參照2000年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級(jí)10例，Ⅱ級(jí)34例，Ⅲ級(jí)23例，Ⅳ級(jí)10例；術(shù)前均未接受放療或化療。取10例經(jīng)病理檢查證實(shí)的非神經(jīng)系統(tǒng)來源的腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本，男性7例，女性3例，年齡（54±2.8）歲（45～72歲）。8例正常腦組織標(biāo)本取自顱腦損傷行內(nèi)減壓術(shù)患者，男性5例、女性3例，年齡（37±4.3）歲（13～61歲）。所有組織標(biāo)本取后立即用10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，研究時(shí)選取典型蠟塊作2～4μm連續(xù)切片。

1.2方法

1.2.1主要試劑

羊抗人LNα1，α2，α3，α5亞基多克隆抗體(濃縮型)購自美國(guó)SantaCruz公司；超敏SP試劑盒購自福州MaixinBio公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)

使用檸檬酸鹽（PH6.0）高溫高壓修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，免疫組織化學(xué)使用超敏SP法，具體參照說明書進(jìn)行。抗體工作濃度（1∶100）。

1.2.3結(jié)果判斷

定位于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上根據(jù)染色程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行分析評(píng)分[3]：著色缺如者為0分、淡者為1分、適中者為2分、深者為3分；著色細(xì)胞占細(xì)胞記數(shù)百分率＜5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、＞50%為3分；每張切片著色與著色百分率得分相乘為其最后得分：規(guī)定0～1分者為陰性（-）、2～3分者為弱陽性（+）、4～6分者為陽性（++）、>6分者為強(qiáng)陽性（+++）。

在腦膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及血管基膜染色陽性的指標(biāo)，利用ImageProPlus6.0軟件測(cè)定陽性染色的血管內(nèi)皮及基膜的平均光密度值（averageopticaldensity，AOD）和陽性染色的微血管管壁厚度（microvascularwallthickness，MWT）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11.5軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用單因素方差分析、Kendall’s等級(jí)相關(guān)分析檢驗(yàn)方法。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1LNα1，α5的表達(dá)

LNα1主要定位在腫瘤細(xì)胞膜上，病理級(jí)別越高染色越強(qiáng)；陽性染色的細(xì)胞呈巢狀分布或散在分布，在少數(shù)高級(jí)別膠質(zhì)瘤標(biāo)本中還可見陽性染色的瘤細(xì)胞圍繞著血管分布，而在血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜無染色（表1～2，圖1）。表1LNα1，LNα5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的陽性表達(dá)強(qiáng)度與病理級(jí)別的關(guān)系（略）表2LNα5在血管內(nèi)皮及基膜中的陽性表達(dá)強(qiáng)度與腦內(nèi)腫瘤惡性程度的關(guān)系（略）

LNα5不僅在所有膠質(zhì)瘤的瘤體及瘤周腫瘤細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)上有染色，且病理級(jí)別越高染色越強(qiáng)；同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜也出現(xiàn)陽性染色，表現(xiàn)為靠管腔的一層內(nèi)皮細(xì)胞和基膜呈連續(xù)、完整的陽性染色，但染色強(qiáng)度在膠質(zhì)瘤各級(jí)別之間無明顯差異。然而，LNα5在正常腦組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜無陽性染色，在腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜也僅見弱陽性染色，但染色基膜呈不連續(xù)，染色強(qiáng)度低于膠質(zhì)瘤組；不過，膠質(zhì)瘤和轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本血管腔中紅細(xì)胞膜上均可見LNα5強(qiáng)陽性染色(圖1,2)。

2.2LNα2、α3的表達(dá)情況LNα2、α3亞基在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞和基膜中均無陽性表達(dá)。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，LN能增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活動(dòng)性，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞粘附和遷移，促進(jìn)腫瘤的侵襲[1,3]。陳菊祥等利用含13939種人類基因的BioStarH40S型芯片篩選人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與侵襲性相關(guān)基因的表達(dá)和功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)層黏連蛋白、血小板衍化生長(zhǎng)因子受體A（PDGFRA）等8條細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)基因均在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中顯著上調(diào)[4]。研究也發(fā)現(xiàn)PDGFRA和LN可以促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲性增強(qiáng)[5]。最近，Kawataki等在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)含α3的LN5和含α5的LN10可強(qiáng)烈的促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移，含α1的LN1作用較弱，含α2的LN2和α4的LN8在體外對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移無促進(jìn)作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，LNα1、α5在膠質(zhì)瘤的瘤體及瘤周、瘤細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜均有表達(dá)，表明LN可由瘤細(xì)胞合成、組裝、分泌；本研究發(fā)現(xiàn)LNα1、α5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞漿膜的表達(dá)強(qiáng)度與病理級(jí)別密切相關(guān)，隨著病理級(jí)別的增高而表達(dá)增強(qiáng)，提示它們可能與瘤細(xì)胞惡性程度有關(guān)，促進(jìn)瘤細(xì)胞之間或瘤細(xì)胞與ECM、血管基膜之間的黏附和遷移。

臨床病理發(fā)現(xiàn)，腦組織雖是身體其他器官原發(fā)癌轉(zhuǎn)移的好發(fā)部位，但顱內(nèi)原發(fā)腫瘤卻很少顱外轉(zhuǎn)移，其原因也被認(rèn)為與LN在腦膠質(zhì)瘤中的分布特征有關(guān)[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，LNα5在膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和基膜上表達(dá)增高，且LNα5在基膜上的表達(dá)是連續(xù)的、完整的，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道基本相符；而在腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤中見LNα5在血管內(nèi)皮和基膜的表達(dá)較弱，且不連續(xù)、有斷裂。提示LNα5可能影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲血管向顱外轉(zhuǎn)移。

基膜上的LN除了可抑制瘤細(xì)胞穿越血管壁而發(fā)生轉(zhuǎn)移外，還可通過與瘤細(xì)胞表面存在LN受體（整合素類和非整合素類）的結(jié)合，誘導(dǎo)瘤細(xì)胞的黏附和遷移[7]。Lugassy等用內(nèi)皮細(xì)胞形成類管腔結(jié)構(gòu)并與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞可沿著管腔外表面前行，并包繞在血管基底膜成分LN的外周[8]。提示本研究中的LNα5可能在影響膠質(zhì)瘤顱外轉(zhuǎn)移的同時(shí)，還誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞沿著血管基膜向正常腦組織遷移。此外，在臨床和不同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也觀察到腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞還常沿有髓纖維（束內(nèi)、束周及束間）侵襲，研究表明雖然腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系能特異地粘附到中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂提取物，但比粘附到純化的LN上明顯要慢[9]。

呂德蘭血型糖蛋白（Lu），也稱為基底細(xì)胞黏附分子（BCAM），是表達(dá)于紅細(xì)胞膜上的一種LN受體，屬于免疫球蛋白超家族，研究表明它與LN的高親和力結(jié)合有助于器官發(fā)生、血管形成、紅細(xì)胞生成，研究還表明它在一些疾病和惡性腫瘤中高表達(dá)，并和其它的黏附受體一起涉及到腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[1011]。Kikkawa等研究發(fā)現(xiàn)在ECM蛋白中，僅僅含α5鏈的LN是Lu/BCAM的配體[12]。本研究發(fā)現(xiàn)LNα5除了在血管內(nèi)皮細(xì)胞和基膜表達(dá)外，還在紅細(xì)胞膜上呈陽性染色，膠質(zhì)瘤和轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本中紅細(xì)胞膜上染色遠(yuǎn)強(qiáng)于正常腦組織，膠質(zhì)瘤與轉(zhuǎn)移瘤之間染色無明顯差異。提示高表達(dá)的LNα5結(jié)合到紅細(xì)胞膜受體上，其來源有可能是內(nèi)皮細(xì)胞合成、分泌的，LNα5與Lu/BCAM相互作用在紅細(xì)胞運(yùn)輸、腫瘤營(yíng)養(yǎng)、血管內(nèi)皮增生/新血管生成等過程中可能起重要作用。

不過，要確切地搞清楚是哪些LN亞基在腦膠質(zhì)瘤的那些生物學(xué)行為中起作用？作用如何？分子機(jī)制何在？還需要借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)（基因敲除，基因轉(zhuǎn)染、RNAi干擾技術(shù)等）在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)（黏附、遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)）中進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1]ColognamH,YurchencoPD.Formandfuncation：thelamininfamilyofheterotrimers[J].DevUyn,2000,218:213234.

[2]江常震,陳錦鋒,何理盛,等.層黏連蛋白,MMP2、MMP9及TIMP1在人腦原發(fā)性膠質(zhì)瘤的表達(dá)及臨床意義[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2001,35(1):49.

[3]林志雄,張鵬飛,江常震,等.人腦膠質(zhì)瘤中LN、FN及p53基因蛋白的免疫組織化學(xué)與其侵襲微生態(tài)系統(tǒng)的相關(guān)性探討[J].解剖學(xué)報(bào),2002,33(4):360365.

[4]陳菊祥,盧亦成,駱純,等.利用基因芯片研究與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲性相關(guān)的基因[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2004,3(2):9395.

[5]LjubimovaJY,LakhterAJ,LokshA,etal.Overexpressionofalpha4chaincontaininglamininsinhumanglialtumorsidentifiedbygenemicroarrayanalysis[J].CancerResearch,2001,61(14):56015610.

[6]KawatakiT,YamaneT,NaganumaH,etal.Lamininisoformsandtheirintegrinreceptorsingliomacellmigrationandinvasiveness:evidenceforaroleofalpha5laminin(s)andalpha3beta1integrin[J].ExpCellRes,2007,313(18):38193831.

[7]RuosatathiE.ControlofcellmotilityandtumorinvasionbyextracellularmatrixinteractionsBrit[J].JCancer,1990,9:289292.

[8]LugassyC,HarounRI,BremH,etal.Pericyticlikeangiotropismofgliomaandmelanomacells[J].TheAmericanJournalofDermatopathology,2002,24(6):473478.

[9]AmbergerVR,PaganettiPA,SeulbergerH,etal.CharacterizationofamembraneboundmetalloendoproteaseofratC6glioblastomacells[J].CancerResearch,1994,54(15):40174025.

[10]KikkawaY,MinerJH.Review:Lutheran/BCAM:ALamininreceptoronredbloodcellsandinvarioustissues[J].ConnectiveTissueResearch,2005,46:193199.

[11]EylerCE,TelenMJ.TheLutheranglycolprotein:amultifunctionaladhesionreceptor[J].Transfusion,2006,46(4):668677.

[12]KikkawaY,MoulsonCL,VirtanenI,etal.IdentificationofthebindingsitefortheLutheranbloodgroupglycoproteinonlamininα5throughexpressionofchimericlamininchainsinvivo[J].JBiolChem,2002,277:4486444869.