導(dǎo)語：如何才能寫好一篇轉(zhuǎn)座子的遺傳學(xué)效應(yīng)，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

[關(guān)鍵詞]RNAi；dsRNA；siRNA

[中圖分類號]R394[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1673-7210（2007）10（b）-007-03

RNAi（RNA interfering，也稱RNA干擾）是利用小雙鏈RNA特異阻斷特定基因的表達(dá)，并促使靶mRNA降解，從而使細(xì)胞表現(xiàn)出某種特定基因缺失表型的現(xiàn)象。由于RNAi對基因表達(dá)的阻斷具有高效、特異性，已迅速發(fā)展成為代替基因敲除的遺傳工具。

1 RNAi的分子作用機(jī)制

經(jīng)過眾多學(xué)者的研究，現(xiàn)已基本闡明了RNAi的作用機(jī)制。在不同生物中RNAi的作用機(jī)制各有不同,主要分為兩種：大于30 nt（核苷酸，nucleotide,nt）的長雙鏈RNA的非特異效應(yīng)和21～23 nt的短雙鏈RNA的特異效應(yīng)[1]。RNAi的特異效應(yīng)作用機(jī)制是在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平等多個(gè)不同的水平上實(shí)現(xiàn)的。其中以siRNA轉(zhuǎn)錄后水平的RNAi研究最為深入，應(yīng)用最為廣泛，下文將做主要介紹(圖1)。

1.1 轉(zhuǎn)錄后水平的RNAi機(jī)制

轉(zhuǎn)錄后水平的RNAi機(jī)制是在對線蟲、果蠅等生物體進(jìn)行研究而進(jìn)一步推導(dǎo)得出來的。不同研究領(lǐng)域的學(xué)者相繼提出了多種RNAi機(jī)制的模型，這些模型大致都將RNAi分為兩個(gè)階段：起始階段和效應(yīng)階段。

起始階段包括：①dsRNA的導(dǎo)入：包括由外源導(dǎo)入或由轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座子、病毒感染等各種方式引入的dsRNA;②dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被一種命名為Dicer的酶切割成21~23 nt長的小分子干擾RN斷（short interfering RNA, siRNA）。

效應(yīng)階段包括：①在siRNA反義鏈指導(dǎo)下，雙鏈siRNA與一個(gè)不同于DICER的RNA酶結(jié)合形成沉默復(fù)合物RISC。②siRNA雙鏈解旋，正義鏈被釋放出來，RISC被激活。③活化的RISC通過堿基配對識別互補(bǔ)的靶mRNA，siRNA反義鏈與mRNA復(fù)合體中換位，并在距siRNA的3'末端12 nt處切割靶mRNA，從而實(shí)現(xiàn)了對mRNA的降解。降解位點(diǎn)多為尿嘧啶。

某些學(xué)者認(rèn)為RNAi過程中還具有自身循環(huán)放大機(jī)制，并將其歸為模型的第三階段――循環(huán)放大階段，其機(jī)制大致如下：

在效應(yīng)階段，活化的RISC結(jié)合mRNA后，內(nèi)切核酸酶將mRNA切割成12~23 nt的片段，特異性地抑制了靶基因的表達(dá)。同時(shí)，釋放出來的siRNA可以作為一種特殊引導(dǎo)物，在RNA依賴的RNA聚合物（RdRP）作用下，以靶mRNA為模板合成新的dsRNA，后者又被降解為新的siRNA，進(jìn)入上述循環(huán)，呈放大效應(yīng)。此過程又稱為隨機(jī)降解性多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）[2]。

1.2翻譯水平的RNAi機(jī)制[1]

翻譯水平上的RNAi是抑制相應(yīng)mRNA的翻譯，使相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)受阻，其中起重要作用的是stRNA (small temporal RNA)，它是由長度約70 nt的RNA形成的莖環(huán)樣前體，經(jīng)Dicer酶作用后形成長約21～23 nt的dsRNA， 通過RISC結(jié)合在相應(yīng)mRNA的3'末端非翻譯區(qū)上,進(jìn)而阻斷mRNA的翻譯。

1.3轉(zhuǎn)錄水平上的RNAi機(jī)制[1]

該機(jī)制是通過siRNA與互補(bǔ)的DNA直接發(fā)生作用，激發(fā)同源DNA甲基化的加強(qiáng)，使目的基因轉(zhuǎn)錄受限，表達(dá)關(guān)閉，進(jìn)而加強(qiáng)了基因沉默。有報(bào)道dsRNA可誘導(dǎo)組蛋白H3及相應(yīng)DNA區(qū)域甲基化。如果甲基化出現(xiàn)在啟動子區(qū)域,則轉(zhuǎn)錄就不能進(jìn)行,如甲基化出現(xiàn)在編碼區(qū),則轉(zhuǎn)錄進(jìn)行,但在轉(zhuǎn)錄后水平上沉默。

1.4 非特異效應(yīng)

許多研究表明，當(dāng)向哺乳動物轉(zhuǎn)染大于30 nt的長雙鏈RNA（dsRNA）時(shí)，由于dsRNA激活雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（dsRNA dependent protein kinase, PKR）途徑[3]，使EIF-2α因子磷酸化，進(jìn)而非特異性地抑制翻譯，從而使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生全面的細(xì)胞沉默。

1.5 RNAi過程所涉及的主要因子

siRNA：是RNAi作用賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。它是長約21~23 nt的雙鏈RNA小分子，與靶mRNA序列具有同源性。此外，siRNA每條單鏈 的3'末端均有2~3個(gè)非配對的堿基[4]。

Dicer酶：Dicer酶（在果蠅中發(fā)現(xiàn)）是一種RNaseⅢ家族中的一種識別dsRNA的酶，據(jù)報(bào)道其結(jié)構(gòu)含有1個(gè)PAZ結(jié)構(gòu)域，1個(gè)氨基螺旋酶結(jié)構(gòu)域，2個(gè)RNaseⅢ模體及2個(gè)dsRNA結(jié)構(gòu)域。在dsRNA導(dǎo)入后，Dicer酶以ATP依賴的、持續(xù)方式連續(xù)切割dsRNA。在對dsRNA進(jìn)行切割時(shí)，Dicer以二聚體形式參與，每個(gè)二聚體包括4個(gè)活性中心，在降解RNA時(shí)其中的2個(gè)要失活,從而使降解過程每隔一定間隔進(jìn)行,這個(gè)間隔正好為22個(gè)核苷酸,即每隔22個(gè)核苷酸Dicer酶將dsRNA降解一次。而Dicer酶結(jié)構(gòu)上的微小改變將會引起間隔的改變,所以不同的物種產(chǎn)生的siRNA長度也略有不同[1]。

RdRP：許多實(shí)驗(yàn)證明，RdRP是RNAi所必需的。RdRP目前僅知其主要是在單鏈siRNA指導(dǎo)下擴(kuò)增RNA而加速RNA的過程。由于RdRP的存在，使RNAi能在低濃度下高效快速地進(jìn)行。

ATP[5]：ATP在siRNA介導(dǎo)中起重要作用，dsRNA被降解為siRNA的過程需要ATP；siRNA解旋，反義鏈與RISC前體結(jié)合形成RISC的過程也依賴ATP。研究還發(fā)現(xiàn)，RNAi過程中外源性ATP不能起促進(jìn)作用。

2 RNAi的特征

高穩(wěn)定性：以3'末端突出的TT堿基的dsRNA尤為穩(wěn)定，無需象反義核酸那樣進(jìn)行進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾以提高半衰期[6]。

高效率：在低于反義核酸幾個(gè)數(shù)量級的濃度下，就能使目標(biāo)基因的表達(dá)降到極低水平甚至完全抑制，從而產(chǎn)生缺失突變體表型[7]。

高特異性：siRNA除正義鏈3'末端突出的2個(gè)堿基在序列識別中不起主要作用外，其他單個(gè)堿基的改變均可能使RNAi效應(yīng)大大減弱。而針對同源基因共有序列的RNAi則導(dǎo)致同源基因共同失活[5]。

高傳遞性：RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以穿過細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持，在某些生物中RNAi還可以傳遞到后代中去。

3 RNAi應(yīng)用過程需要解決的幾個(gè)問題

避免非特異性效應(yīng)：前述已闡明，在哺乳動物中，當(dāng)大于30 nt的dsRNA被導(dǎo)入時(shí)，可激活PKR途徑而導(dǎo)致非特異性抑制。這就要求在設(shè)計(jì)dsRNA時(shí)必須考慮該dsRNA導(dǎo)入時(shí)能否避免非特異性效應(yīng)的出現(xiàn)。多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，以21~23 nt為最佳選擇。

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干涉dsRN段的獲取和導(dǎo)入：在實(shí)際應(yīng)用中，siRNA的長度、結(jié)構(gòu)、組成及其觸發(fā)的效果基因、種屬、序列、細(xì)胞類型、甚至實(shí)驗(yàn)體系的不同而有變異。目前，siRNA的獲取大多數(shù)仍舊是生化合成，其設(shè)計(jì)仍處于試驗(yàn)階段，能否成功地設(shè)計(jì)出合理實(shí)用的siRNA對其能否廣泛應(yīng)用起決定性作用。對RNAi效應(yīng)的調(diào)控：目前對RNAi的研究還限于以雙鏈干涉片段抑制特定基因的表達(dá)，對其調(diào)控的干涉較少。但大量的研究表明，dsRN段的大小、潛在靶位、活性片段濃度等都是RNAi有效性發(fā)揮的影響因素。Yang等還證實(shí)RNAi現(xiàn)象可被過剩的不相關(guān)的dsRNA競爭性抑制，深入的研究表明，甚至過剩的正義鏈與反義鏈也可競爭性抑制RNAi效應(yīng)。

4 RNAi的應(yīng)用及前景

4.1遺傳學(xué)研究的應(yīng)用

4.1.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子RNAi缺陷可引起內(nèi)源性轉(zhuǎn)座子的移動。轉(zhuǎn)座子的重要特征之一是具有反向重復(fù)序列，生物體通過此序列可以產(chǎn)生dsRNA發(fā)夾，啟動PTGS效應(yīng)，所以抑制轉(zhuǎn)座子的移動有利于遺傳穩(wěn)定，防止遺傳損害。因此人們認(rèn)為RNAi的一個(gè)自然功能就是轉(zhuǎn)座子沉默[8]。

4.1.2 基因功能分析人類基因組計(jì)劃中的基因測序已經(jīng)完成，人類將進(jìn)入后基因組時(shí)代。其主要任務(wù)是確定基因的功能，因此迫切需要建立有效、經(jīng)濟(jì)的分析基因的技術(shù)。

盡管目前對RNAi機(jī)制并未完全弄清，但其高效、特異阻斷基因的表達(dá)已在某些研究中開展。RNAi克服了傳統(tǒng)基因功能分析技術(shù)要求高，過程繁等缺點(diǎn)，已吸引了越來越多學(xué)者的重視。可以預(yù)見，RNAi將成為新一代基因組功能研究的有力工具。

4.2 臨床應(yīng)用

4.2.1 抗病毒David等認(rèn)為在動物中RNAi代表一種古老的抗病毒反應(yīng)，與植物的PTGS（轉(zhuǎn)錄后的基因沉默）一樣可抵抗病毒的感染，目前這一觀點(diǎn)已被普遍認(rèn)可。

目前，利用體外培養(yǎng)人類細(xì)胞研究抗病毒感染，主要限于單鏈 RNA病毒，包括人類免疫缺陷病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等。Novina[9]等用針對CD4的siRNA轉(zhuǎn)染Magi-CCR5細(xì)胞，產(chǎn)生了對CD4受體表達(dá)特異性抑制達(dá)75%，Northern雜交發(fā)現(xiàn)CD4分子的mRNA明顯降低了8倍，從而阻斷了HIV-1病毒細(xì)胞。Kapadie等[10]用針對HCV的siRNA與表達(dá)HCV的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人的肝癌細(xì)胞株Huh-7細(xì)胞，2 d后，Northern雜交檢測顯示：HCV的RNA含量下降，證明了HCV特異的siRNA抑制了病毒的復(fù)制[9]。

RNAi在針對其他病毒，如呼吸道合胞病毒、SARS病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒，豬瘟病毒等均顯示出抑制病毒復(fù)制的作用。最近有文獻(xiàn)報(bào)道RNAi在研制抗SARS藥物中顯示出特殊的作用。

從當(dāng)前的這些研究結(jié)果可以看出，siRNA通過序列特異性干擾作用，能封閉病毒基因在體內(nèi)的復(fù)制，RNAi成為控制病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的重要工具，為病毒治療提供了新的思路。

4.2.2 抗腫瘤利用RNAi的高效率和高度特異性，我們可以設(shè)計(jì)特異siRNA分子，沉默目標(biāo)基因，而正?；虿皇苡绊?。這是用RNAi抗腫瘤的基本思路。從現(xiàn)階段研究的進(jìn)展看來，RNAi有望成為新一代研究抗腫瘤的重要工具，發(fā)揮重要作用。

腫瘤是多因素、多基因的疾病，單個(gè)癌基因的抑制難以達(dá)到治療效果，用基因敲除等方法進(jìn)行治療研究就造成了時(shí)間和經(jīng)費(fèi)的浪費(fèi)。RNAi技術(shù)可同時(shí)抑制多個(gè)基因，且抑制效果互不干擾，并且RNAi識別可以精確到單個(gè)核苷酸，對由野生型突變形成的癌基因，如ras、p53等，能產(chǎn)生準(zhǔn)確有效的封閉效果，而野生型不受影響[11]。Wilda等針對bcr/abl基因融合位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一段21 nt長的dsRNA分子，特異性沉默了該融合基因，并使表達(dá)該融合基因的細(xì)胞凋亡，而對不表達(dá)該基因的腫瘤無任何作用。最近，Linsl等把針對bcl2基因的mRNA-cDNA雜交體轉(zhuǎn)染到人前列腺癌lncap細(xì)胞中，產(chǎn)生了長時(shí)期的阻抑bcl2表達(dá)效應(yīng)，這一效應(yīng)與體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞中的RNAi非常相似。

5 結(jié)語

RNAi的發(fā)現(xiàn)改變了人們對細(xì)胞基因調(diào)控的傳統(tǒng)思路，提供了特異性阻斷基因表達(dá)的新工具和評價(jià)基因功能的新策略，為人類基因功能研究和疾病基因治療開辟了一條革命性的新領(lǐng)域。盡管其機(jī)制仍未完全弄清，但RNAi技術(shù)在病毒、腫瘤等尚未根治的疾病提供了新的治療方案，并帶來根治的希望。目前RNAi在各方面的研究已經(jīng)日新月異，可以相信，不久的將來，將會出現(xiàn)基于RNAi的基因治療藥物，RNAi技術(shù)也將成為未來生命研究的重要工具。

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(收稿日期:2007-08-23)

篇2

[關(guān)鍵詞]桔梗；同源四倍體；DNA甲基化；MSAP

[Abstract]In order to investigate the epigenetic variations between diploid and autotetraploid of Platycodon grandiflorus.the diploid buds of P. grandiflorus were soaked in the mixture of different concentration colchicines and 0.002 g?mL-1 dimethyl sulphoxide （DMSO）.The identification of autotetraploid plants were based on morphological characteristics，chromosome number and flow cytometry. And then the level and pattern of DNA methylation explored by using the technology of methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP）.The result demonstrated that the buds soaked in 0.2% colchicines and 0.002 g?mL-1 DMSO solution for 12 h was ideal conditions to induce autotetraploid of P. grandiflorus，with induction rate of 32.0%.The diploid and tetraploid plants existed distinctly differences in morphological indexes.Totally，1 586 bands were amplified by 20 pairs of selective primers，of which 764 and 822 bands were detected in diploid and autotetraploid respectively.The total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio were 91.25%，61.25% and 30.65% in diploid of P. grandiflorus，respectively.However，the total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio of autotetraploid of P. grandiflorus were 86.13%，54.38% and 31.75%， respectively. Compared with diploid，the genomic DNA total methylate ratio and full methylation ratio of autotetration plants decreased by 6.02% and 7.14%.But the hemimethylated ratio of autotetraploid was higher than that of diploid，which more than 1.6%.All this results indicated that DNA methylation patterns have adjusted during the polyploidy process.

[Key words]Platycodon grandiflorus； autotetraploid； DNA methylation； MSAP

多倍體是指含有3套或3套以上完整染色體組的生物體[1]。由于多倍體將1個(gè)或多個(gè)整套染色體累加到基因組上，對生物體的基因組產(chǎn)生了一定沖擊，這種“基因組沖擊”使生物體的新陳代謝和基因調(diào)控等發(fā)生改變，從而使植株的形態(tài)器官、生理指標(biāo)、遺傳特性等產(chǎn)生變異[2-5]，這些變異會增強(qiáng)植株的生態(tài)適應(yīng)性和環(huán)境的抗逆性，降低蒸騰作用，提高光合效率等，對植株的生物量和某些次生代謝產(chǎn)物含量及品質(zhì)有促進(jìn)作用[6]。因此多倍體植物具有更大的生存潛能和更強(qiáng)的選擇優(yōu)勢。研究表明，多倍化不僅能導(dǎo)致植物的基因組結(jié)構(gòu)改變、堿基序列消除、轉(zhuǎn)座子激活等，還能影響表觀遺傳調(diào)控模式[7-8]。表觀遺傳變異是指不改變DNA堿基序的一種可遺傳的基因表達(dá)變化，包括DNA甲基化修飾、組蛋白的各種修飾等[9]，其中DNA甲基化修飾是研究多倍體表觀遺傳變異的最佳途徑之一[10]。DNA甲基化能在分子水平上對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，保護(hù)基因組結(jié)構(gòu)的完整性，并控制冗余基因的表達(dá)，保持多倍體植物基因組的穩(wěn)定性 [11-12]。多倍化能夠誘導(dǎo)DNA甲基化的改變，而DNA甲基化又在基因組調(diào)控和基因表達(dá)上起到一個(gè)樞紐的作用，因而用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（MSAP）研究不同倍性植株基因組DNA甲基化的表達(dá)水平及模式變化，在一定程度上對解釋多倍體植株出現(xiàn)的新的表型具有重要的意義。

目前多倍體方面的研究主要集中于異源多倍體的物種[13-16]，而對同源多倍體化后所產(chǎn)生的一系列變化方面的相關(guān)文章較少，這是因?yàn)楫愒炊啾扼w化后較同源多倍體化后引起的變化更為明顯[17-18]。但是，異源多倍體帶來的雜交效應(yīng)將混淆于倍性引起的后果[19]，因此，僅依賴于倍性調(diào)控變化方面的研究應(yīng)通過同源多倍體來體現(xiàn)，揭示僅由基因組加倍而不涉及雜交等其他因素所造成的基因組沖擊以及隨后多個(gè)基因組趨于穩(wěn)定的內(nèi)在機(jī)制也需通過同源多倍體的研究來闡明。

桔梗為常用大宗藥材，具有開宣肺氣，祛痰排膿的功效[20]，在我國南北各地大面積栽培。但長期以來只種不選，導(dǎo)致品種退化，藥材產(chǎn)量和品質(zhì)下降[21]。本研究在采用生物技術(shù)離體誘導(dǎo)并鑒定獲得桔梗同源四倍體的基礎(chǔ)上，采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）技術(shù)對二倍體和四倍體基因組DNA的甲基化變化情況進(jìn)行分析，一方面為桔梗的品種選育提供材料，另一方面從表觀遺傳學(xué)的角度探討桔梗四倍體表型變化的分子機(jī)制，為多倍體育種提供一定的理論依據(jù)。

1材料

挑選籽粒飽滿的桔梗種子，經(jīng)流水沖洗40 min后置于超凈工作臺，用75%乙醇消毒30 s后轉(zhuǎn)入0.1%升汞（HgCl2）中滅菌6 min，無菌水清洗3～5次，接入MS培養(yǎng)基，25～30 d后獲得桔梗無菌系。

2方法

2.1桔梗無菌快繁體系的建立和優(yōu)化

以桔梗幼芽為材料，接種到增殖和生根培養(yǎng)基上，增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度6-BA（6-芐氨基嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）和2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）；生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，并添加不同濃度NAA（α-萘乙酸）和IBA（吲哚丁酸）進(jìn)行生根培養(yǎng)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，2。每個(gè)處理15個(gè)幼芽，5瓶重復(fù)，培養(yǎng)30 d后分別統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和生根率。

2.2桔梗同源四倍體的離體誘導(dǎo)及鑒定

2.2.1桔梗同源四倍體的離體誘導(dǎo)具體方法參照王紅娟等[22]，并作適當(dāng)調(diào)整。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，0.1%，0.2%的秋水仙素（加0.02 g?mL-1二甲亞砜）混合液經(jīng)20 mL的注射器和0.22 μm的水系濾頭抽濾滅菌后將桔梗不定芽浸泡在其中，置于震動搖床內(nèi)處理12，24，36，48，60 h，然后用無菌水沖洗3次后接種到MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。以清水浸泡作為對照，共15個(gè)處理，每個(gè)處理15個(gè)幼芽，做5次重復(fù)。

2.2.2桔梗同源四倍體的鑒定采用形態(tài)鑒別、流式細(xì)胞儀分析和根尖染色體鑒定相結(jié)合的方法來確定倍性株系。先將形態(tài)變異明顯的植株進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，具體方法參照張俊娥等[23]，稱取0.5 g組培苗葉片，用濾紙吸干水分后置于干凈培養(yǎng)皿中，加入2 mL預(yù)冷的組織解離液（80 mmol?L-1KCl，20 mmol?L-1NaCl，15 mmol?L-1Tris-HCl，20 mmol?L-1Na2EDTA，0.1% TritonX-100，2.0% PVP-K30，pH 7.5），用刀片一次性快速切碎葉片，過濾后于4 ℃環(huán)境下2 000 r?min-1離心5 min，漂洗2～3次，加入2 mL DAPI染液室溫下反應(yīng)1 h后即可上樣測定。流式細(xì)胞儀鑒定的株系進(jìn)一步采用根尖壓片法確定植株染色體數(shù)目。具體方法參照張振超等[24]，早上9：00～11：00點(diǎn)取幼苗根尖（0.5～1 cm），在0.002 mol?L-1的八羥基喹啉預(yù)處理2～3 h，于4 ℃冰箱中卡諾固定液（乙醇-冰醋酸 3∶1）處理24 h，在60 ℃的1 mol?L-1 HCL中解離8 min，卡寶品紅染色10 min，然后制片、鏡檢。

2.3總DNA提取

稱取0.5 g二倍體和四倍體桔梗試管苗幼葉，采用改良的CTAB法進(jìn)行DNA提取，具體方法參照陳昆松等[25]，提取的DNA經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)測定濃度和純度后用并1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，總DNA 置于-20 ℃冰箱待用。

2.4MSAP分析及聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.4.1酶切、鏈接反應(yīng)MSAP試驗(yàn)步驟參照Portis等[26]方法，用雙切酶組合EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoR Ⅰ/ MspⅠ對基因組DNA進(jìn)行酶切，在酶切片段的兩端加上人工設(shè)計(jì)的與EcoRⅠ和Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ酶切位點(diǎn)互補(bǔ)的人工接頭，然后用AFLP擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，接頭和引物序列見表3。引物由北京博友順生物科技有限公司合成。

2.4.2預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增和電脈預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中含有10 mmol?L-1 dNTPs 0.4 μL，10×Buffer 2 μL，5 U?μL-1Taq酶0.2 μL，10 μmol?L-1 E00-primer 0.5 μL，10 μmol?L-1 M00-primer 0.5 μL，其余用水補(bǔ)齊。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，26個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，供選擇擴(kuò)增用。

選擇擴(kuò)增體系同預(yù)擴(kuò)增體系，條件為：94 ℃ 30 s，65 ℃至56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降0.7 ℃進(jìn)行降式PCR 擴(kuò)增；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

選擇性擴(kuò)增完成后在擴(kuò)增PCR產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，94 ℃變性10 min 后然后立即轉(zhuǎn)移到冰上冷卻防止復(fù)性，取5 μL變性產(chǎn)物于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分析，銀染后觀察。

2.5條帶統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

由于甲基敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)中分別用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ雙切酶對基因組DNA進(jìn)行酶切。因此每個(gè)樣品同時(shí)擁有2條泳道：第1條泳帶采用EcoRⅠ/HpaⅡ進(jìn)行酶切，記為H，第2條泳帶采用EcoRⅠ/ MspⅠ進(jìn)行酶切，記為M。同一位點(diǎn)有條帶的記為“1”，無帶的記為“0”。

3結(jié)果與分析

3.1增殖及生根培養(yǎng)基優(yōu)化

將長1.5～2 cm的桔梗不定芽接到7種增殖培養(yǎng)基中，經(jīng)30 d培養(yǎng)后均出現(xiàn)不定芽增殖的現(xiàn)象，具體結(jié)果見表4，在4號培養(yǎng)基中，分化的芽數(shù)最多，增殖系數(shù)平均達(dá)9.3±0.24，且出芽整齊，生長健壯，葉色濃綠。因此，桔梗無菌苗增殖的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg?L-1+ NAA 0.3 mg?L-1。

生根培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果見表5，不同濃度的NAA和IBA對桔梗試管苗生根率、根生長狀況均有影響，隨著NAA和IBA濃度的增大，生根率逐漸降低，且出根不整齊，根細(xì)短。當(dāng)培養(yǎng)基蔗糖含量為28 g?L-1，NAA質(zhì)量濃度為0.6 mg?L-1時(shí)，平均生根率高達(dá)82.6±3.8，且根粗壯，整齊。由此可見，桔梗的最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.6 mg?L-1。

3.2桔梗同源四倍體的誘導(dǎo)結(jié)果

將桔梗不定芽用抽濾滅菌的秋水仙素（加0.02 g?mL-1二甲亞砜）混合液浸泡處理后，成功得到了桔梗同源四倍體植株。誘導(dǎo)結(jié)果見表6，不同的質(zhì)量濃度和處理時(shí)間對不定芽的誘導(dǎo)效果不同，低濃度和短時(shí)間處理下誘導(dǎo)率低，但成活率高，隨著質(zhì)量濃度和處理時(shí)間的增加，誘導(dǎo)率逐漸提高，但不定芽成活率降低。根據(jù)四倍體植株的誘導(dǎo)率和成活率，篩選出最佳處理濃度和時(shí)間，即用0.1%的秋水仙素溶液處理48 h或0.2%的秋水仙素溶液處理12 h為桔梗同源四倍體誘導(dǎo)的最佳條件。

3.3桔梗同源四倍體的鑒定

一般而言，四倍體植株具有巨型化特征，將形態(tài)變異明顯的植株先經(jīng)流式細(xì)胞儀分析后，再用根尖壓片法鑒定，見圖1。結(jié)果表明，桔梗二倍體植株根尖染色體數(shù)為2n=2x=18，DNA相對含量在100處有1個(gè)單峰；同源四倍體植株染色體數(shù)為2n=4x=36，DNA相對含量在200處有1個(gè)單峰，見圖2。

3.4桔梗二倍體和同源四倍體基因組DNA甲基化水平差異

MSAP技術(shù)中同裂酶HpaⅡ和MspⅠ都能識別并切割CCGG序列，但二者識別甲基化的位點(diǎn)不同，HpaⅡ能切割無甲基化和單鏈甲基化位點(diǎn)而不能切割雙鏈甲基化位點(diǎn)；MspⅠ能切割無甲基化和內(nèi)甲基化位點(diǎn)而不能切割外甲基化位點(diǎn)，因此經(jīng)HpaⅡ和MspⅠ切割后在聚丙烯酰胺凝膠電泳分析膠上能檢測出4種條帶類型，即：Ⅰ型，H，M都有帶，說明CCGG位點(diǎn)無甲基化；Ⅱ型，H有帶，M無帶，說明CCGG位點(diǎn)發(fā)生單鏈外甲基化，即半甲基化；Ⅲ，H無帶，M有帶，說明CCGG位點(diǎn)發(fā)生雙鏈內(nèi)甲基化，即全甲基化；Ⅳ，H，M都無帶，說明CCGG位點(diǎn)有雙鏈內(nèi)外側(cè)甲基化、雙鏈外甲基化或無CCGG序列[16]。桔梗二倍體和同源四倍體DNA經(jīng)MSAP擴(kuò)增的條帶數(shù)及甲基化水平見表7，用20對引物組合共擴(kuò)增后共有1 586條條帶，其中二倍體764條，四倍體822條。二倍體總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別為92.15%，61.52%，30.65%，而四倍體的為86.13%，54.38%，31.75%，與桔梗二倍體相比，其同源四倍體總甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，而半甲基化率升高1.6%，這說明染色體加倍后其DNA甲基化水平發(fā)生了變化。

3.5桔梗二倍體和同源四倍體基因組DNA甲基化類型

二倍體和同源四倍體桔?；蚪MDNA甲基化類型見表8，二倍體和四倍體共有15種條帶，見圖3。其中A型為單態(tài)性位點(diǎn)，包括3個(gè)亞類，表示二倍體與四倍體甲基化狀態(tài)相同；B型為去甲基化位點(diǎn)，包括5個(gè)亞類，說明在該位點(diǎn)二倍體存在甲基化，而四倍體發(fā)生了去甲基化；C型為過或超甲基化類型，也有5個(gè)亞類，即與二倍體相比，四倍體甲基化升高；D型為次甲基類型，有2個(gè)亞類，表示相比于二倍體來說，四倍體甲基化降低，但仍有甲基化現(xiàn)象[17]。與二倍體相比，桔梗試管苗染色體加倍后，其基因組DNA有23.54%發(fā)生了去甲基化現(xiàn)象，29.07%發(fā)生了過或超甲基化現(xiàn)象，2.97%發(fā)生了次甲基化現(xiàn)象，只有44.42%的基因組DNA未發(fā)生任何改變。

4討論與結(jié)論

4.1桔梗同源四倍體的離體誘導(dǎo)及鑒定

本研究中采0.2%抽濾滅菌的秋水仙素溶液浸P11～P20.其中的10對引物，每對引物下有4條泳道，從左往右依次為2H，2M，4H，4M；2H和4H分別表示二倍體和四倍體桔梗EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ酶切的擴(kuò)增結(jié)果；2M和4M表示二倍體和四倍體桔梗EcoR Ⅰ/Msp Ⅱ酶切的擴(kuò)增結(jié)果。

泡桔梗頂芽12 h，獲得了誘導(dǎo)率為32.0%的四倍體植株。高山林等[27]采用培養(yǎng)基中添加40 mg?L-1秋水仙素的方法誘導(dǎo)桔梗四倍體，誘導(dǎo)率達(dá)到37.5%；王小華等[28]采用0.1%秋水仙素處理桔梗嫩莖40 h，誘導(dǎo)率達(dá)到50%。前人誘導(dǎo)率較高的原因可能是在鑒定過程中僅用形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)的方法鑒定倍性，并沒有排除嵌合體的干擾，從而將嵌合率也計(jì)算到誘導(dǎo)率中，出現(xiàn)誘導(dǎo)率較高的現(xiàn)象，本研究采用了形態(tài)鑒別、流式細(xì)胞儀分析和根尖染色體鑒定相結(jié)合的方法進(jìn)行倍性鑒定，排除了嵌合體的干擾，提高了結(jié)果的可靠性，為進(jìn)一步研究桔梗同源四倍體的遺傳穩(wěn)定性和農(nóng)藝性狀評價(jià)提供可靠的材料。

4.2桔梗二倍體與四倍體基因組DNA甲基化水平差異及模式變化

多倍體植物具有器官巨大、活性成分含量高、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，這可能是多倍化后植物體內(nèi)基因組結(jié)構(gòu)和表觀遺傳修飾發(fā)生了廣泛變化[3]，進(jìn)而導(dǎo)致植物出現(xiàn)新的性狀。但在對擬南芥[5]、水稻[29]、白菜[18]的同源多倍體及二倍體的比較研究中發(fā)現(xiàn)這些植物同源多倍化后基因組結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯改變，且多倍化后多倍體的基因表達(dá)譜也與二倍體十分相似。表明同源多倍化后基因組并沒有同異源多倍化一樣發(fā)生大規(guī)模的基因組結(jié)構(gòu)調(diào)整事件。本研究中，從圖1可以明顯看出桔梗同源四倍體比二倍體植株粗大，葉片增厚增大，葉柄葉脈粗大等現(xiàn)象，同源多倍體桔梗新出現(xiàn)的區(qū)別于親本的性狀則可能與表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)。

甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾形式，在基因表達(dá)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，同源多倍化過程中，DNA甲基化會參與多倍體的適應(yīng)性調(diào)整，并發(fā)生特異性的變化以調(diào)控基因表達(dá)和轉(zhuǎn)座子的活性等，所以不同倍性材料中DNA甲基化水平會發(fā)生一定程度的改變[29]。楊嵐等[30]采用MSAP技術(shù)對甜葉菊同源四倍體與二倍體的表觀遺傳進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)四倍體基因組DNA的總甲基化率和全甲基化率略有所降低，甲基化模式主要以過和超甲基化為主；長春花[31]多倍化后基因組CCGG位點(diǎn)的 DNA的總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率較二倍體植株均有所提高，甲基化類型以C型即過或超甲基化類型最多。本研究中，桔梗同源四倍化后基因組DNA的總甲基化率和全甲基化率有所降低，其中總甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，且甲基化模式主要以過或超甲基化類型（C型）為主，占29.07%，其次是去甲基化（B型），占23.54%，最少的是次甲基化（D型），占2.97%。由此可推測同源四倍體出現(xiàn)新的表型與DNA甲基化模式的重新調(diào)整尤其是大量過或超甲基化變異有關(guān)，過或超甲基化就可能導(dǎo)致相應(yīng)位點(diǎn)所在基因表達(dá)的關(guān)閉或抑制，進(jìn)而維持四倍體植株這自身基因組的穩(wěn)定性。有關(guān)染色體加倍后DNA甲基化模式調(diào)整的程度對多倍體性狀和表型改變的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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