導(dǎo)語：大鼠移植肝保護(hù)管理論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的探討川芎嗪（TMP）對大鼠移植肝的保護(hù)作用。方法參照Delriviere和Kamada等方法建立大鼠肝移植模型，將大鼠隨機(jī)分為3組：A組（假手術(shù)組）、B組（肝移植對照組）和C組（TMP干預(yù)組）。采用全自動生化分析儀檢測術(shù)后血清肝功能(AST、ALT、LDH)水平；應(yīng)用免疫組化SP法結(jié)合病理圖像分析儀測定肝組織中Bcl-2、Bax的表達(dá)情況；HE染色觀察其病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果（1）C組AST、ALT、LDH明顯低于B組（P<0.01）。（2）C組Bcl-2或Bcl-2/Bax表達(dá)明顯高于B組（P<0.05），而Bax表達(dá)無明顯變化（P>0.05）。（3）A組無明顯病理形態(tài)改變，B組術(shù)后肝組織出現(xiàn)明顯的病理損害，C組病理變化明顯減輕。結(jié)論TMP可能通過上調(diào)Bcl-2或Bcl-2/Bax表達(dá)而減輕肝移植體的低溫保存再灌注損傷，對供肝有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】肝移植；保存再灌注損傷；川芎嗪；Bcl-2；Bax

Protectiveeffectoftetramethylpyrazineonlivergraftinratlivertransplantation

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectoftetramethylpyrazine(TMP)preconditioningonlivergraftinratlivertransplantation.MethodsPerformingtheoperationoflivertransplantationinmaleSprague-DawleyratsreferredtoDelriviereandKamadawithcuffanastomosingmethods，theratswererandomlydividedintothreegroups：Agroup(n=6，shamoperationgroup)，Bgroup(n=30×2，livertransplantationcontrolgroup)，Cgroup(n=30×2，TMPgroup).Theparametersofliverfunction(AST，ALTandLDH)weretestedbyauto-biochemicalanalyseringroupBandCafterreperfusion0.5h，3h，6h，24h，48hrespectivelyviatheplasmasamples；partofthelivertissuewassampledtodeterminetheexpressionofBcl-2andBax.TheparametersingroupAwereexamed3haftertheoperation.TheexpressionofBcl-2andBaxwasdeterminedbyimmunohistochemistytechniquewithpathologicalimaginganalyser.Also，partsoflivertissuesampleswereusedtodetectthehistopathologicchanges.Results（1）ThelevelsofAST，ALTandLDHweresignificantlydecreasedingroupCcomparedwiththatingroupB（P＜0.01）afterreperfusion0.5h，3h，6h，24h，48hrespectively.（2）TheexpressionofBcl-2weresignificantlyincreasedingroupCcomparedwiththatingroupB（P＜0.01）afterreperfusion0.5h，3h，6hrespectively.ThedifferentexpressionofBaxbetweengroupCandgroupBwasnonsignificant.（3）ApproximatelynormallymorphologicstructurewasfoundingroupA，someobvioushistopathologicchangesingroupBcouldbeseenmorphologically.ButingroupC，somehistopathologicchangeswerealleviated.ConclusionTMPcanimproveliverfunctionandalleviatehistopathologicdamageinlivertransplantationinratsduringpreservationandreperfusioninjuryprobablybyup-regulatingtheexpressionofBcl-2orBcl-2/Baxandexertaprotectiveeffectonlivergraft.

【Keywords】livertransplantation；preservationandreperfusioninjury；tetramethylpyrazine；Bcl-2；Bax

肝移植是治療終末期肝病最有效的手段，肝移植體低溫保存再灌注損傷是肝移植術(shù)后肝原發(fā)性無功能（PFN）的重要原因，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。目前人們針對凋亡發(fā)生的各個環(huán)節(jié)，探索各種防治方法，從而減輕肝移植體保存再灌注損傷成為了研究的熱點(diǎn)。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP，四甲基吡嗪）是從中藥川芎中分離、純化的一種生物堿，TMP具有抑制血小板的聚集、改善微循環(huán)、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、對抗氧自由基的氧化作用以及鈣拮抗作用；TMP作為鈣拮抗劑，可能通過激活腺苷酸環(huán)化酶及抑制鈣離子內(nèi)流作用而抑制細(xì)胞凋亡［1］；TMP還可以影響c-fos表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡［2］。但目前TMP在細(xì)胞內(nèi)的分子機(jī)制研究甚少，需進(jìn)一步研究。TMP是否影響移植肝保存再灌注損傷細(xì)胞凋亡調(diào)控基因的表達(dá)，尚未見報道。本實(shí)驗通過建立大鼠肝移植模型，觀察TMP對保存再灌注損傷中肝組織Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，探討TMP對大鼠移植肝的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1材料封閉群雄性SD大鼠126只，供體體重200～250g，受體體重340～380g，實(shí)驗動物購于中南大學(xué)實(shí)驗動物中心。SSW-3X顯微外科手術(shù)器械包（上海醫(yī)療器械有限公司）。Q550CW自動病理圖像分析儀（德國LEICA公司）。TMP（40mg/2ml/支，北京第四制藥廠）。Bcl-2、Bax免疫組化試劑盒、AST、ALT、LDH試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）。

1.2實(shí)驗分組及處理封閉群SD大鼠（n=126）隨機(jī)分為3個組：A組（n=6，假手術(shù)組）、B組（n=30×2，肝移植對照組）、C組（n=30×2，TMP干預(yù)組）；B、C組再根據(jù)再灌注后0.5h、3h、6h、24h、48h不同時相，又分為5個亞組。

1.3制備大鼠肝移植模型參照Delriviere和Kamada等［3］方法建立大鼠肝移植模型。安體醚吸入麻醉，供體肝上上腔靜脈結(jié)扎，供體肝下上腔靜脈與受體右腎靜脈按照Delriviere等［4］方法行袖套吻合（套管內(nèi)徑為2.0~2.2mm、外徑為2.8~3.0mm）；供肝門靜脈與受體門靜脈行袖套吻合（套管內(nèi)徑為1.5~1.8mm、外徑為2.0~2.2mm）；結(jié)扎受體肝固有動脈；最后將供肝膽管與受體膽管采用套管法重建（內(nèi)徑為0.65mm、外徑0.96mm硬膜外導(dǎo)管）。B組：灌洗及保存液為4℃冷平衡鹽溶液（含肝素鈉5u/ml）；C組：灌洗及保存液為冷平衡鹽溶液中加TMP（320g/L）；A組：開腹后游離肝周韌帶，分離膽總管及門靜脈，關(guān)腹。

1.4標(biāo)本的采集和檢測B、C組觀察術(shù)后的一般情況，并分別于肝移植再灌注后0.5h、3h、6h、24h、48h取腹主動脈血待測肝功能（AST、ALT、LDH），同時取移植肝一小塊肝組織待制石蠟標(biāo)本；A組于關(guān)腹后3h取標(biāo)本作為正常對照。采用全自動生化分析儀進(jìn)行肝功能測定；利用免疫組織化學(xué)染色的方法結(jié)合病理圖像分析測定各切片中細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax表達(dá)情況。取部分切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.5免疫組化染色方法石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性；微波修復(fù)抗原，加封閉用羊血清，37℃孵育15min；加1∶50Bcl-2或1∶50Bax抗體工作液，4℃孵育過夜；滴加生物素的羊抗兔IgM（1∶100），37℃孵育30min；每張切片滴加50μlSP復(fù)合物，于37℃孵育30min；以新鮮配制的DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察。鏡下可見陽性染色主要位于胞漿內(nèi)，少數(shù)為核膜，呈淺黃、棕黃或棕褐色顆粒。每張切片內(nèi)中外隨機(jī)選取6個視野，運(yùn)用病理圖像分析儀顯微鏡下觀察并測定陽性細(xì)胞的輝度值（與Bcl-2、Bax表達(dá)成反比）。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法所有計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，在計算機(jī)上用SPSS11.0軟件包處理，方差齊性分析后，組間比較用均數(shù)t檢驗，組內(nèi)比較用單因素方差分析，組內(nèi)不同時點(diǎn)間兩兩比較采用q檢驗，指標(biāo)間相關(guān)分析用直線相關(guān)分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1一般情況本實(shí)驗肝移植60例，供體手術(shù)時間、血管袖套準(zhǔn)備時間、受體手術(shù)時間、無肝期分別為（29.65±3.18）min、（9.05±2.12）min、（42.64±4.07）min、（5.18±1.23）min。手術(shù)成功率為88.33%（53/60）。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，肝移植TMP干預(yù)組較肝移植對照組在供肝恢復(fù)血流后，其表面很快呈鮮紅色，無花斑狀表現(xiàn)，門靜脈不擴(kuò)張，肝臟無腫脹，腸管無淤血，腸系膜動脈搏動有力，膽汁源源不斷流出，上述表現(xiàn)明顯優(yōu)于肝移植對照組。

2.2肝組織形態(tài)學(xué)變化假手術(shù)組（A組）無明顯形態(tài)學(xué)改變；肝移植對照組（B組）術(shù)后肝組織隨著再灌注時間的延長，病理變化逐漸加重：肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞濁腫，變性呈顆粒狀，肝竇變窄，中性粒細(xì)胞附壁，繼而出現(xiàn)細(xì)胞核染色加深及部分核濃縮，部分還出現(xiàn)點(diǎn)狀或小片狀壞死，以術(shù)后6h最嚴(yán)重，6h后，病理變化隨著再灌注時間的延長逐漸減輕；肝移植TMP干預(yù)組（C組）病理變化較B組相應(yīng)時點(diǎn)明顯減輕：輕度的組織水腫，肝竇內(nèi)皮滲出較少，小葉結(jié)構(gòu)基本完好，炎癥細(xì)胞浸潤較少（見圖1～2）。

2.3大鼠各組AST、ALT、LDH含量與A組比較，B、C組各時點(diǎn)AST、ALT、LDH含量均顯著性增加（P＜0.01）；與B組相應(yīng)的時點(diǎn)比較，C組各時點(diǎn)AST、ALT、LDH含量顯著性降低（P＜0.01）；B、C組內(nèi)各時點(diǎn)間AST、ALT、LDH含量單因素方差分析差異顯著（P＜0.01），且每兩個時點(diǎn)間q檢驗有顯著性時效關(guān)系（P＜0.05），見表1。

注：A組AST、ALT、LDH含量分別為（82.78±5.60）u/L、（48.80±4.30）u/L、(564.83±30.66)u/L；與A組比較，△P＜0.01；與B組比較，#P＜0.01

2.4各組Bcl-2、Bax表達(dá)輝度值變化與A組比較，B、C組于肝移植缺血再灌注后0.5h、3h、6hBcl-2表達(dá)顯著性增加（P＜0.01），Bax表達(dá)顯著性降低（P＜0.01）；與B組比較，C組0.5h、3h、6hBcl-2表達(dá)顯著性上調(diào)（P＜0.01），Bax表達(dá)差異無顯著性；并且B、C組內(nèi)各時點(diǎn)Bcl-2、Bax表達(dá)差異有非常顯著性（P＜0.01），且每兩個時點(diǎn)間q檢驗有顯著性時效關(guān)系（24h與48h間例外）（見表2、圖3～6）。

注：A組Bcl-2、Bax陰性對照值均為（153.09±1.61）/μm2；△與A組各時點(diǎn)Bcl-2值比較，P＜0.01，Bax值P＜0.01；#與B組各時點(diǎn)Bcl-2值比較，P＜0.01，Bax值P＞0.05

2.5肝功能（AST、ALT、LDH）水平與Bcl-2、Bax表達(dá)的相關(guān)性AST、ALT、LDH水平與Bcl-2的表達(dá)呈顯著性負(fù)相關(guān)，r值分別為-0.39（P＜0.05）、-0.51（P＜0.01）、-0.52（P＜0.01）；AST、ALT、LDH水平與Bax的表達(dá)呈顯著性正相關(guān)，r值分別為0.71、0.54、0.75，P＜0.01；AST、ALT、LDH水平與Bcl-2/Bax表達(dá)呈顯著性負(fù)相關(guān)，r值分別為-0.73、-0.72、-0.86，P＜0.01。

3討論

肝移植術(shù)后肝原發(fā)性無功能是肝移植后死亡的主要原因，與肝移植低溫保存再灌注損傷密切相關(guān)［5］，其中細(xì)胞凋亡在組織細(xì)胞的丟失和器官功能衰竭方面發(fā)揮著重要作用［6，7］。肝移植體從可逆到不可逆的轉(zhuǎn)變反映了肝細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞凋亡的精細(xì)平衡，基因調(diào)控是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控機(jī)制［8］。

Bcl-2基因家族是最受關(guān)注的基因之一，任何一個死亡啟動子與Bcl-2或Bcl-XL形成異型二聚體時，細(xì)胞就可以避免發(fā)生凋亡［9］。Bcl-2蛋白是一種膜整合蛋白，主要分布在線粒體內(nèi)膜細(xì)胞膜內(nèi)表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜等處，具有抑制凋亡的作用［10］。目前認(rèn)為其抗凋亡的主要機(jī)制是：抑制細(xì)胞內(nèi)織網(wǎng)鈣庫釋放鈣，維持細(xì)胞內(nèi)鈣的穩(wěn)定；恢復(fù)線粒體膜電位和調(diào)制線粒體內(nèi)外膜之間通透性轉(zhuǎn)變孔（PTP），抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素C、凋亡蛋白激活因子（APAF-1）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等［11，12］；抑制Caspase如Caspase-9的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡級聯(lián)放大反應(yīng)［13，14］；直接抗氧化，對抗氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡［15］；抑制凋亡蛋白Bax及Bak的細(xì)胞毒作用等。本實(shí)驗結(jié)果顯示移植肝對照組再灌注0.5h即出現(xiàn)Bcl-2表達(dá)增加，與假手術(shù)組比較差異有非常顯著性（P<0.01），隨再灌注時間延長，Bcl-2表達(dá)進(jìn)行性降低，肝功能形態(tài)損害進(jìn)行性加重，再灌注后6h最明顯，提示移植肝在保存再灌注損傷中可能通過增加Bcl-2表達(dá)而抑制凋亡，但其作用是有限的，隨著再灌注時間延長，其抑制作用逐漸減弱。TPP干預(yù)組Bcl-2表達(dá)比肝移植對照組顯著性上調(diào)（P<0.01），肝功能形態(tài)損害明顯減輕，提示TMP可能上調(diào)Bcl-2表達(dá)，進(jìn)一步抑制凋亡而保護(hù)移植肝。

Bax為Bcl-2家族中的一員，與Bcl-2不同的是，Bax是促進(jìn)凋亡。其機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)Caspase的釋放來實(shí)現(xiàn)的，而Caspase能激活來自線粒體的細(xì)胞色素C，因而可能對抗Bcl-2的抑制細(xì)胞凋亡作用［16，17］；Bax的過度表達(dá)還可以促進(jìn)細(xì)胞因子缺乏介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)Bax的表達(dá)在肝移植后，隨著再灌注時間延長逐漸增加，以再灌注6h最明顯，后又進(jìn)行性下降，24h后基本恢復(fù)正常（與假手術(shù)組比較），提示移植肝保存再灌注期間可能激發(fā)Bax表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，TMP干預(yù)對Bax表達(dá)無明顯影響。

綜上所述，川芎嗪可以通過上調(diào)Bcl-2或Bcl-2/Bax表達(dá)而有效地減輕肝移植體的低溫保存再灌注損傷，對供肝有保護(hù)作用。但其上調(diào)Bcl-2或Bcl-2/Bax表達(dá)的具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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