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【摘要】X-連鎖無(wú)丙種球蛋白血癥（X-linkedagammaglobulinemia，XLA）屬于原發(fā)性體液免疫缺陷病中的一種，又叫Bruton病。近年來(lái)，由于Bruton酪氨酸激酶（Bruton’sagammaglobulinemiatyrosinekinase，BTK）基因突變導(dǎo)致B細(xì)胞發(fā)育障礙，所以不能產(chǎn)生免疫球蛋白。本文就近年來(lái)對(duì)BTK的遺傳學(xué)特性、基因突變分析、分子致病機(jī)制及診斷和治療等的研究進(jìn)展作一綜述。

【關(guān)鍵詞】X-連鎖無(wú)丙種球蛋白血癥（XLA）；Burton酪氨酸激酶（BTK）；診斷；治療

【Abstract】X-linkedagammaglobulinemia（XLA）belongstotheprimaryimmunodeficiencydisease（PID），whichcallsBrutondisease.Recently，itcannotgenerateimmuneglobulin，becauseofthemutationoftheBruton’sagammaglobulinemiatyrosinekinase（BTK）gene，whichleadstodevelopmentaldisorderoftheBcell.Thisarticlereviewsthegeneticcharacters，mutationanalysis，molecularpathogenicmechanismandtherapyoftheBKTgene.

【Keywords】XLA；BTK；diagnosis；therapy

X連鎖無(wú)丙種球蛋白血癥（X-linkedagammaglobulinemia，XLA），又稱Bruton無(wú)丙種球蛋白血癥，是最早發(fā)現(xiàn)的人類原發(fā)性免疫缺陷病（primaryimmunodeficiencydisease，PID）之一，Bruton（1952年）首次報(bào)道?；颊吲R床上以反復(fù)細(xì)菌感染為特征，血清中各類免疫球蛋白明顯降低或缺乏，對(duì)抗原刺激不能產(chǎn)生抗體應(yīng)答，血循環(huán)中B淋巴細(xì)胞減少，淋巴結(jié)及淋巴組織缺乏生發(fā)中心和淋巴濾泡，骨髓中無(wú)漿細(xì)胞，但前B淋巴細(xì)胞數(shù)量正常，T淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能正常。典型病例為出生后半年左右開(kāi)始反復(fù)化膿感染（如肺炎鏈球菌或嗜血流感桿菌）或遲至幼年發(fā)病，患者體內(nèi)缺少成熟B細(xì)胞，基本上不能自主產(chǎn)生免疫球蛋白，必須依靠免疫替代療法維持體液免疫水平。該病嚴(yán)重危害患者健康，危及患者生命。80%～90%［1］臨床診斷病例可檢出相關(guān)致病基因BTK發(fā)生突變，而其他10%～20%［1］的病人存在其他問(wèn)題，有研究顯示常染色體編碼Igφ［2，3］、μHC［4］和LC的基因存在突變。

1BTK的遺傳學(xué)特性大多數(shù)PID的遺傳形式已經(jīng)明確，幾乎均為單基因遺傳，多數(shù)為常染色體隱性遺傳，其次為X連鎖隱性和常染色體顯性遺傳。大多數(shù)情況男性發(fā)病，女性攜帶，但也有男性攜帶者不發(fā)病的報(bào)道。60%的PID突變基因的DNA序列已被克隆，突變位點(diǎn)（包括突變基因定位的染色體節(jié)段和基因位點(diǎn)）和突變形式（單個(gè)核苷酸缺失、替代、插入、移碼突變、無(wú)義或錯(cuò)義突變等）也已確定［5］。在WHOPID專家委員會(huì)的指導(dǎo)下，成立了有關(guān)疾病基因庫(kù)，記錄登記全球范圍的PID基因突變及其類型。多基因遺傳性PID的確定較困難，至今尚無(wú)確切的報(bào)道。

1.1BTK的蛋白結(jié)構(gòu)BTK蛋白為B細(xì)胞信號(hào)傳遞系統(tǒng)中的重要蛋白，屬于非受體型蛋白酪氨酸激酶Tec家族的一員，該家族的成員還包括TEC、ITK/TSK/EMT和BMX。Tec家族蛋白酪氨酸激酶包括5個(gè)不同的結(jié)構(gòu)區(qū)段（見(jiàn)圖1），從N末端起為PH（pleckstrinhomology；PH）段，約有120個(gè)氨基酸，TH（Techomology；TH）段約有60～80個(gè)氨基酸SH3（Srchomology3;SH3）段約有60個(gè)氨基酸，SH2段約100個(gè)氨基酸，激酶催化段約280個(gè)氨基酸［6］。

圖1BTK蛋白的組成（從N端開(kāi)始）包括5個(gè)區(qū)域：PH、TH、SH3、SH2和激酶區(qū)。

注：圖上邊的數(shù)字代表各段的氨基酸長(zhǎng)度，圖下邊的數(shù)字代表不同的外顯子及其相應(yīng)的位置。

BTK蛋白的空間結(jié)構(gòu)多數(shù)已測(cè)明，包括PH區(qū)、TH區(qū)的前半部、SH3區(qū)和激酶催化區(qū)［7］，SH2區(qū)的結(jié)構(gòu)可借用其他蛋白激酶的類似結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。這些三維空間結(jié)構(gòu)可用于分析突變?cè)斐傻牡鞍卓臻g結(jié)構(gòu)的改變。

1.2BTK基因的分子結(jié)構(gòu)及其突變分析在20世紀(jì)80年代，多位學(xué)者應(yīng)用DNA多態(tài)性標(biāo)志分析的方法，成功地將XLA的缺陷基因定位于X染色體中部（Xq21.3-22）的2cm區(qū)域內(nèi)［8］。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病變基因區(qū)內(nèi)分離鑒定了一個(gè)新的基因，該基因表達(dá)于正常人各期B淋巴細(xì)胞，在XLA患者中發(fā)生突變，故認(rèn)為是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK基因全長(zhǎng)37.5kb，含有19個(gè)外顯子，除第一外顯子外，其余18個(gè)編碼BTK蛋白的659個(gè)氨基酸，分子量為76KD［9］。cDNA含有2560個(gè)核苷酸，有一個(gè)編碼659個(gè)氨基酸多肽的開(kāi)放閱讀框架，起始密碼子在核苷酸第133位置上，在起始位置上游的15個(gè)密碼子處閱讀框架閉合。根據(jù)國(guó)際研究小組BTK突變分析，迄今已經(jīng)在471個(gè)家族544個(gè)XLA病人中發(fā)現(xiàn)了BTK基因341個(gè)獨(dú)立存在的堿基置換、插入或缺失，其中有13個(gè)大段缺失和2個(gè)大段插入。突變不僅存在于19個(gè)外顯子，還涉及內(nèi)含子和啟動(dòng)區(qū)域。其中，發(fā)生頻率最高的是錯(cuò)義突變，其次是無(wú)義突變和拼接位點(diǎn)突變。錯(cuò)義突變主要發(fā)生在三聯(lián)體密碼子的前兩位。外顯子8和9的185~287位沒(méi)有錯(cuò)義突變，這些位點(diǎn)可能不易突變或是功能上不重要。33%的替代累及CPG雙核苷酸，這是目前認(rèn)為的最常見(jiàn)的突變熱點(diǎn)［10］，而突變高頻位點(diǎn)R520也屬于CPG突變［6］。編碼外顯子蛋白突變的區(qū)域［11］（見(jiàn)表1）。表1編碼外顯子蛋白突變的區(qū)域

2BTK的分子致病機(jī)制BTK屬于非受體酪氨酸蛋白激酶，該類激酶廣泛參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，影響細(xì)胞的存活、增殖和分化，BTK是B細(xì)胞發(fā)育成熟的關(guān)鍵因素。正常人除T細(xì)胞和漿細(xì)胞外均有BTK表達(dá)，而B(niǎo)TK基因突變只影響B(tài)細(xì)胞的數(shù)量，這說(shuō)明BTK在B細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。目前對(duì)BTK參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)研究比較清楚的是BCR交聯(lián)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。其過(guò)程簡(jiǎn)述如下：BCR交聯(lián)激活Pl-3激酶并產(chǎn)生一定數(shù)量的Pl-3，4，5-risphosphate與膜結(jié)合，Pl-3，4，5-risphosphate與BTK的SH3段作用使其定位于細(xì)胞膜。然后，BTK經(jīng)過(guò)兩步活化：首先BTK激酶段Y551位磷酸化（很可能是與Lyn作用），接著是SH3段Y223位的自身磷酸化?；罨蟮腂TK與B細(xì)胞銜接蛋白（BLNK）結(jié)合并激活phospholipaseC-γy（PLC-γ），導(dǎo)致鈣離子通道打開(kāi)，胞外鈣離子內(nèi)流。該信號(hào)傳導(dǎo)途徑最終導(dǎo)致細(xì)胞增生加強(qiáng)和轉(zhuǎn)錄的變化。此模式僅限于以B細(xì)胞受體交聯(lián)作為刺激信號(hào)，至于前B細(xì)胞受體交聯(lián)是否也引起相同的信號(hào)傳導(dǎo)目前還缺乏證據(jù)［1，12］。該信號(hào)傳導(dǎo)途徑受FcRⅡB和SHIP（SH2-containinginositol-5-phosphatase）磷酸酶介導(dǎo)的另一途徑制約，通過(guò)水解Pl-3，4，5-risphosphate和Ins（1，3，4，5）-etraphosphate關(guān)閉鈣離子內(nèi)流通道［13］。BTK不僅可以由BCR和FCR介導(dǎo)激活，也可以通過(guò)其他很多受體激活，包括G-protein-coupledreceptors（GPCR）、IL-3、IL-5和IL-6，另外，CD19和單克隆抗體的交聯(lián)也可激活BTK［13］，近年來(lái)研究表明，CD40也是B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的重要受體，傳遞刺激信號(hào)影響細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和分化。與BCR介導(dǎo)的BTK活化途徑相似，CD40的交聯(lián)也可激活BTK。CD40和BCR可能是B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中不同階段激活BTK的信號(hào)傳遞通路。但也有研究提示CD40不通過(guò)BTK也可提高NFKB和JNK的水平，是獨(dú)立于BTK的信號(hào)傳導(dǎo)通路［14～16］。BTK在細(xì)胞內(nèi)與很多分子相互作用，共同構(gòu)成了一種微環(huán)境，在信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程中起著重要的作用。這些分子分別與BTK的不同區(qū)段相互作用，其中與PH段作用的分子研究得很多，R28附近區(qū)域與PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas作用。PH-TH區(qū)域與Gαq和Gβ雙體作用;SH3與c-Cb1、WASp、Vav和sab作用;SH2與磷酸化的BLNK作用。另外，SH3與TH在BTK分子內(nèi)作用，抑制BTK的活性。在BCR交聯(lián)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，Syk和BLNK對(duì)BTK的活化起正向調(diào)節(jié)作用，磷酸化的PKCs、sab和IBTK對(duì)BTK的活化有抑制作用。盡管與BTK作用的分子很多，但是它們?nèi)绾螀f(xié)調(diào)地與BTK作用，完成BTK參與的信號(hào)傳導(dǎo)，機(jī)制目前尚不清楚［17，18］。

3XLA的診斷XLA是一種原發(fā)性體液免疫缺陷癥，危害著人們的健康。因而，對(duì)該癥進(jìn)行產(chǎn)前診斷和女性攜帶者的鑒定就顯得十分重要［19］。為了研究XLA家系女性成員的情況，F(xiàn)earon等采用了X染色體失活的方法去發(fā)現(xiàn)攜帶狀況以及驗(yàn)證B淋巴細(xì)胞發(fā)育的內(nèi)在缺陷。根據(jù)這一方法用重組DNA探針同時(shí)發(fā)現(xiàn)RFLP和X染色體基因甲基化。在無(wú)攜帶狀態(tài)的女性的外周血粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)X染色體的隨機(jī)失活。相反，該癥的三個(gè)攜帶者在外周B淋巴細(xì)胞兩個(gè)X染色體中的一個(gè)優(yōu)先失活，但不是T細(xì)胞或粒細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈地支持XLA是由B淋巴細(xì)胞發(fā)育的內(nèi)在缺陷所致的假設(shè)。Lovering（1994）等［20］對(duì)BTK基因缺失患者DNA分子斑點(diǎn)雜交分析見(jiàn)到了已改變的DNA限制性片段，并對(duì)7個(gè)患者家庭用已經(jīng)改變的限制性片段方法對(duì)與患者有關(guān)的女性攜帶狀況作出診斷。隨后，Schuster等［21］報(bào)道了對(duì)所有19個(gè)外顯子。包括側(cè)翼內(nèi)含子邊界采用PCR-SSCP方法成功地檢測(cè)到兩例男性患兒BTK的SH2功能區(qū)的新突變，并用一個(gè)已改變過(guò)的第一個(gè)引物做PCR擴(kuò)增突變發(fā)生，作出三代中健康女性攜帶者的鑒定。接著，Hagemann等［22］對(duì)一個(gè)散發(fā)的XLA患兒及家庭的三代成員應(yīng)用PCR擴(kuò)增基因組DNA，采用序列分析的方法直接鑒定XLA的基因突變，結(jié)果診斷出患兒及其免疫學(xué)表現(xiàn)正常的女性攜帶者。以上這些方法均可應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。這無(wú)疑對(duì)優(yōu)生優(yōu)育是很有意義的。

4XLA的治療研究免疫重建是采用正常細(xì)胞或基因片段植入患兒體內(nèi)，使之發(fā)揮功能，以持久地糾正缺陷的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。1968年使用HLA配型同種異體骨髓移植治療2例致死性免疫缺陷病獲得成功。至今已有近2000例PID患兒接受骨髓移植，總存活率為62%，其中同型合子骨髓移植達(dá)79%。無(wú)關(guān)供體配型骨髓（matchedunrelatedmarrowdonor，MUD）移植在近年已很盛行，成功率約為50%，5歲以內(nèi)接受移植者可達(dá)85%［23］。近年開(kāi)展臍血干細(xì)胞移植，存活率為75%。用母體骨髓CD34+干細(xì)胞宮內(nèi)移植（腹腔注射）已有成功的報(bào)道［5］。將正常目的基因片段整合到患兒干細(xì)胞基因組內(nèi)（基因轉(zhuǎn)化），隨細(xì)胞有絲分裂，轉(zhuǎn)化的基因片段能在患兒體內(nèi)復(fù)制而持續(xù)存在。理論上講，凡能通過(guò)骨髓移植治愈的疾病均是基因治療的指針［24］。基因治療PID的嘗試已經(jīng)歷多年，取得一定成效，但尚處于探索和臨床驗(yàn)證階段［25］。Faust等［26］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是通過(guò)免疫球蛋白的增強(qiáng)子和驅(qū)動(dòng)子介導(dǎo)的小鼠BTKcDNA轉(zhuǎn)錄至兩組免疫缺陷鼠（XLD或BTK-/-鼠）。轉(zhuǎn)入1個(gè)拷貝的XLD或BTK-/-鼠經(jīng)蛋白印跡法檢測(cè)其BTK達(dá)到正常量的25%；而轉(zhuǎn)錄2個(gè)拷貝者其BTK達(dá)到正常量的50%。兩組小鼠經(jīng)檢測(cè)均有正常數(shù)量的脾B細(xì)胞，兩組小鼠對(duì)TNP一蔗聚糖刺激所產(chǎn)生抗體的反應(yīng)和血清IgM、lgG3水平較正常野生鼠明顯減低，但較XID小鼠有所提高。Drabek等［27］通過(guò)人類BTKcDNA與鼠主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ區(qū)調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)基因治療，糾正了BTK缺陷鼠的B細(xì)胞功能，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入的基因并不表達(dá)于前B細(xì)胞以前的分化階段，此外它在胸腺上皮細(xì)胞、活化T細(xì)胞、單核細(xì)胞上表達(dá)，并在其他組織均有低水平表達(dá)。經(jīng)蛋白印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，BTK蛋白總含量可達(dá)到與野生型鼠相同。這些研究均向我們提供了基因治療XLA的可能性。此外，Rohrer等［28］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用極少量正常骨髓細(xì)胞輸注即可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)使XID小鼠獲得B系統(tǒng)免疫重建。這項(xiàng)研究推測(cè)，即使不成功的基因治療也可對(duì)XLA患者有益，為今后開(kāi)展人類XLA的基因、細(xì)胞治療提供有利的基礎(chǔ)和廣闊的前景?？傮w上說(shuō)，盡管目前基因治療離成熟的臨床治療技術(shù)還有相當(dāng)?shù)木嚯x，但經(jīng)過(guò)近10年的臨床試驗(yàn)，人們已獲得了大量寶貴的臨床資料。我們有理由相信，XLA的基因治療將在不久的將來(lái)獲得突破性進(jìn)展。

5展望盡管80%～90%臨床診斷為XLA的病人依靠BTK突變檢測(cè)確診為XLA，但是XLA的基因突變位點(diǎn)很多，與臨床癥狀的相關(guān)性不強(qiáng)，同一家系中的XLA病人臨床表現(xiàn)程度很可能各不相同。即：基因型和臨床表型的關(guān)系是目前需要研究的課題之一［29］。這涉及到突變基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和二維構(gòu)像［30，31］。這樣，通過(guò)基因突變及其對(duì)蛋白的影響無(wú)法預(yù)知XLA的病程、復(fù)雜程度、B細(xì)胞數(shù)量和免疫球蛋白的水平。只有徹底明確BTK在B細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的作用機(jī)制，才能找到基因突變和臨床癥狀的相關(guān)性，完善XLA的基因診斷，并為治療奠定理論基礎(chǔ)［32］。1994年，國(guó)際上成立了BTK基因突變分析小組并建立了BTK基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uta.fi/imt/bioinfo/btkbase/），為XLA的基因診斷提供了便利的條件。但是數(shù)據(jù)庫(kù)中的病源主要來(lái)自西方國(guó)家、日本和俄羅斯，而國(guó)內(nèi)的BTK基因研究相對(duì)處于空白階段。因此，目前開(kāi)展BTK基因突變的檢測(cè)工作應(yīng)成為國(guó)內(nèi)同類研究的重點(diǎn)，通過(guò)建立有效可靠的BTK基因突變篩查方法，研究中國(guó)人BTK基因突變的規(guī)律。因此，隨著對(duì)PID認(rèn)識(shí)的深入和檢測(cè)方法的簡(jiǎn)化，將會(huì)有更多的病例被確診，不僅可以用常規(guī)方法治療，而且可以做基因分析，同時(shí)，建立PID登記網(wǎng)絡(luò)［33］，也將有助于了解確切的發(fā)病率和需要治療的患者?？傊?，來(lái)自突變基因的BTK蛋白還沒(méi)有被完全認(rèn)識(shí)，在蛋白質(zhì)水平這些突變的結(jié)果還不清楚。BTK基因突變?cè)赬LA發(fā)病機(jī)制中更詳細(xì)作用還不清楚，但作為疾病基因，對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)的研究，將為未來(lái)的體細(xì)胞基因治療創(chuàng)造條件。當(dāng)然，體細(xì)胞治療存在著一定的問(wèn)題，目前還不能達(dá)到此目的，但這是今后研究的一個(gè)重要方向，基因治療無(wú)疑是近20年來(lái)分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)迅速發(fā)展的一種結(jié)果。由于體內(nèi)大劑量靜脈丙種球蛋白的長(zhǎng)期替代療法有不少的副作用，且價(jià)格昂貴，不能根本解決問(wèn)題。若能將缺陷的基因進(jìn)行原位的修補(bǔ)，基因治療將是最理想的根治方法。

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