導語：南極魚抗凍蛋白功能和進化研究一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

在6500萬年前的新生代時期,南極大陸開始緩慢移動,同時其溫度逐漸降低,到大約2000萬年前溫度降到0℃以下。隨著海水溫度的降低,多數(shù)魚類由于無法適應而滅絕[1]。部分魚類發(fā)生了適應性進化,適應了極端寒冷環(huán)境而生存下來,形成了現(xiàn)在的南極魚類。據(jù)統(tǒng)計,占地球海洋總面積約10%的南大洋擁有的魚類包括50個科,322個種,僅占地球魚類總數(shù)的1.3%。其中硬骨魚南極魚亞目(Notothenioids)魚類達120多種,占南大洋所有魚類的46%,而在南極洲周圍海域南極魚亞目比例高達90%[2]。南極魚常年生活在穩(wěn)定的、極端寒冷和氧氣充足的南極海域中,在生化和生理功能等方面發(fā)生了許多適應性改變和新的性狀以適應南極的極端環(huán)境,其中抗凍蛋白是南極魚適應極端寒冷環(huán)境的最重要特征之一[3-4]。20世紀60年代,科學家首次在南極冰魚(Nototheniidae)血液中發(fā)現(xiàn)抗凍糖蛋白(antifreezeglycoprotein,AFGP)[4]。目前已知大多極地魚類和冷水魚體內都可以產(chǎn)生抗凍蛋白(antifreezeprotein,AFP)或抗凍糖蛋白,這些蛋白質可以把魚類體液的冰點降低,從而在環(huán)境水域冰點之下仍能保持體液的流動性,避免冷凍損傷的發(fā)生[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn),其他極地物種包括昆蟲、植物、微生物也可以產(chǎn)生抗凍蛋白[6]。隨著對抗凍蛋白認識的不斷深入,科學家漸漸把抗凍蛋白應用在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品和工業(yè)等多個領域。

1南極魚類抗凍蛋白分子特征和適應性進化

目前至少1種抗凍糖蛋白和4種抗凍蛋白已經(jīng)被鑒定出來,它們分布在多種分類地位相差很遠的極地魚類中。這些抗凍蛋白的氨基酸序列和空間結構都不相同,但都具有結合冰晶并抑制冰晶生長的功能。最初在南極冰魚(Nototheniidae)中發(fā)現(xiàn)AFGP,由一個糖三肽(Thr-Ala-Ala)基本結構單位重復組成,Thr殘基上可以連接雙糖基團(β-D半乳糖基,1,3-α-N-乙酰氨基半乳糖),糖基上發(fā)生化學修飾會降低AFGP的抗凍活性。魚類可以合成一系列大小不一的AFGP分子,由不同數(shù)量的糖三肽單位聚合而成。根據(jù)糖三肽單位重復數(shù)目不同,AFGP可分為8個類別,重復數(shù)為4~50,分子量從2.7~32kD[7]。魚類的AFP也根據(jù)氨基酸組成和結構差異進行分類。I型抗凍蛋白(AFPI)存在于北極和北大西洋的扁魚(Pleuronectespp.)和杜父魚(Myoxoce-phalusspp.)中,是3.5~4.5kD的小分子肽。AFPI分子中富含丙氨酸(Ala),形成一個幾乎規(guī)范的alpha螺旋結構[8]。II型抗凍蛋白(AFPII)是分子量1417kD的多肽,富含半胱氨酸(Cys),分布范圍較窄,目前僅在大西洋鯡(Clupeaharengus)和美絨杜父魚(Hemitripterusamericanus)等幾種魚中發(fā)現(xiàn)AFPII[9]。III型抗凍蛋白(AFPIII)是研究最為廣泛的一種抗凍蛋白,主要分布在極地海域和大西洋的幾種綿鳚亞目(Zoarcidae)的魚中,包括斷線真狼綿鳚(Lychodyichthysdearborni)和北極狼綿鳚(Locodespolaris)[10]。目前已經(jīng)從南極大頭鰻鱺(Lycodichthysdearborni)的血漿中分離出8種AFPIII成分,包括3種主要成分(RD1、RD2、RD3)和5種少量成分[11-12]。AFPIV是從多棘床杜父魚(Myoxocephalusoctodecimspinosis)血清中分離到的一種抗凍蛋白(LS12)[13],分子量約12.3kD,含108個氨基酸殘基,其中17%是谷氨酰胺,N末端被焦谷氨酰基團所封閉。AFPIV廣泛分布于硬骨魚類中,具有降低冰點和冰晶修飾等AFP的特征性功能[13]。抗凍蛋白的進化是南極魚寒冷適應的一個重要機制,其中南極魚的AFGP從頭進化機制是近年來的重要發(fā)現(xiàn)。南極魚類的AFGP基因由功能上不相關的胰蛋白酶原基因(trypsinogen)演化而來。trypsinogen第一內含子和第二外顯子交接處的編碼Thr−Ala−Ala的9核苷酸序列在5′端微衛(wèi)星DNA序列的引導下擴增,首先形成一個trypainogen−AFGP中間分子,隨后經(jīng)歷了大部分trypsiongen編碼區(qū)序列缺失而形成獨立的AFGP編碼基因,并進一步通過分子內大規(guī)模擴增形成一個龐大的AFGP基因家族[14]。北極魚類的AFGP蛋白在氨基酸序列上與南極魚類的AFGP幾乎沒有區(qū)別,但經(jīng)過研究卻發(fā)現(xiàn)北極魚類的AFGP蛋白在基因進化上與trypsinogen毫無關系[4]。有研究發(fā)現(xiàn)來自于南極大頭鰻鱺的AFPIII基因起源于一個唾液酸合成酶(SAS)基因拷貝[15]。IV型AFP與其他類型的魚類AFP相似度較低,被鑒定并歸類為新的IV型AFP,并且這種蛋白質被認為是從載脂蛋白進化而來的[13]?？箖龅鞍谆蚱鹪吹陌l(fā)現(xiàn)揭示了一種新基因起源的進化機制,同時也把分子進化、環(huán)境適應和物種分化緊密地聯(lián)系在一起。

2抗凍蛋白的作用機制

抗凍蛋白作用機制在于可以結合微小的冰晶并抑制冰晶的繼續(xù)生長?？箖龅鞍滓苑且罃?shù)性形式降低水溶液的冰點而對其熔點(meltingpoint,MP)影響甚微,從而導致水溶液的熔點(MP)和冰點(freezingpoint,FP)之間出現(xiàn)差值,這個差值稱為熱滯活性(thermalhysteresisactivity,THA)[16]。THA已被用于定量描述AFP的活性(圖1),對于大多數(shù)魚類AFP,觀察到的THA約為1℃。在冬季(–1.9℃),這種溫度差距可以為海水提供足夠的緩沖,使極地魚在寒冷的環(huán)境中生存[17]?？箖龅鞍椎牡诙€功能是冰重結晶抑制(icerecrystal-lizationinhibition,IRI)。冰重結晶(IR)解釋了一個熱力學上有利的過程,其中較大的冰晶的形成以犧牲較小的冰晶為代價。較大的冰晶對于冷凍保存的細胞以及棲息在極地或寒冷地區(qū)的生物體可能是致命的,而抗凍蛋白可以在非常低的濃度下抑制冰重結晶,冰晶晶體之間界面處的AFP可以與冰粒表面結合并抑制其生長過程,其依賴AFP的冰重結晶抑制機制仍不是很明確[18-19]。將含AFP的溶液與30%蔗糖以1∶1的比例混合。將混合溶液點在兩個蓋玻片之間并快速冷凍。然后,將樣品置于–6℃,并在特定時間段內觀察變化。如圖1所示,較大的冰粒以較小的冰晶為代價而增長,而在AFP存在的情況下,在較低的面板中停止生長[20]。冰重結晶抑制更可能是耐寒生物在極冷環(huán)境中生存的關鍵屬性,冰重結晶抑制被認為可以保護細胞膜免受凍傷。圖1使用改良的激冷板實驗檢測AFP的冰重結晶抑制功能[20]Fig.1IcerecrystallizationinhibitionassayofAFPusingmodifiedsplatassay[20]熱滯活性(THA)和冰重結晶抑制(IRI)均基于AFP對冰的親和力。然而,THA并不總是與IRI活性成正比(圖2),較低THA活性的AFP可以表現(xiàn)出較高的IRI活性[20]。Olijve等[21]證明了AFPⅢ及其突變體顯示出不同的THA值,但具有幾乎相同的IRI活性。與中度熱滯活性的抗凍蛋白LeIBP相比,高熱滯活性的抗凍蛋白FfIBP卻在IRI中表現(xiàn)出較低的活性[22]。這些結果提示,抗凍蛋白的THA并不能夠直接轉化為生物樣品的冷凍保存效率,因此不能僅靠THA來考慮AFP在冷凍保存中的應用。

3抗凍蛋白在醫(yī)學領域的應用研究

抗凍蛋白的熱滯活性(THA)和冰重結晶抑制(IRI)活性使其在冷凍保存中具有重要作用。冷凍保存可用于在極低溫度下儲存各種類型的細胞、組織和器官、鮮冷食品等,已成為生命科學、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、農(nóng)業(yè)等領域的關鍵技術。冷凍保存中最重要的是避免冰晶形成導致的細胞損傷。目前常用的冷凍保存劑(如二甲基亞砜和甘油)可以減少冰的形成,但高濃度的冷凍保存劑對細胞具有毒性[23]。解凍期間的冰再結晶也是冷凍保存對細胞損傷的重要因素,而AFP在抑制冰再結晶,提高冷凍保存效率方面具有良好的應用潛力。3.1在生殖醫(yī)學領域中的應用冷凍保存是生殖醫(yī)學領域的關鍵技術之一,可以解決不孕不育、延遲生育等問題。AFP可應用于精子、卵子和胚胎等組織器官的冷凍保存[24]。研究報道極地魚類來源的抗凍蛋白AFPIII對小鼠卵母細胞的冷凍保存具有顯著的保護作用。使用抗凍蛋白明顯降低了小鼠卵母細胞冷凍保存−復蘇后的損傷,ROS的產(chǎn)生、DNA雙鏈斷裂程度和細胞凋亡的程度明顯降低,復蘇后卵子的發(fā)育完整性增強,使用抗凍蛋白冷凍保存的受精卵發(fā)育水平明顯高于對照組[25-26]。在牛的卵子玻璃化冷凍保存研究中發(fā)現(xiàn),抗凍蛋白AFGP-8的加入也明顯降低了冷凍損傷的發(fā)生,提高了冷凍卵母細胞復蘇后正常發(fā)育的水平[27]。在魚類的胚胎冷凍保存實驗中也發(fā)現(xiàn),用加入含有AFPI的冷凍保存液進行顯微注射或孵育的魚胚胎,在低溫(4℃或–10℃)冷卻后存活率顯著提高[28-29]。哺乳動物精子的冷凍保存技術比較成熟,但也有研究報道AFP和AFGP在精子冷凍保存中發(fā)揮重要作用,可明顯降低冷凍損傷,提高精子的活力和漿膜的完整性[30-32]。這些研究表明AFP在精子、卵子、胚胎冷凍保存中具有廣泛的應用價值。3.2在外科中的應用冷凍手術是目前腫瘤治療的一項關鍵技術,研究報道手術前將少許AFP注射到待切除組織中,可以提高手術成功率,減少冷凍手術后的目標組織發(fā)生冷凍損傷問題[33]。AFP也被用于器官移植手術的組織、器官的冷凍保存,AFP在器官冷凍儲存中的保護效果受多種因素的影響,包括AFP的濃度、冷凍保護液的成分等。如有研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的AFGP對低溫儲存的心臟沒有保護作用[34]。同時有報道AFP可以保護低溫保存的大鼠心臟,用含有AFP的保存液保存的心臟在移植手術后具有更高的存活率、表現(xiàn)出更好的血流動力學參數(shù)和更低的細胞凋亡水平[35-36]。目前對AFP在組織、器官低溫儲存中的作用機理和應用潛能方面的研究較薄弱,該方面的基礎研究對AFP在醫(yī)學領域的應用開發(fā)是急需開展的。

4抗凍蛋白在食品領域的應用研究

抗凍蛋白作為食品添加劑可以抑制冰晶生長,改善冷凍食品的品質[37]。添加有AFP的冰激凌,冰碴的產(chǎn)生顯著減少,而未加AFP的冰淇淋樣品中冰晶較大且不均勻,AFP添加改善了冰激凌的質量和口感[38]。抗凍蛋白還可以應用在冷鮮、冷凍食品的儲存和運輸環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)AFP在肉類的冷凍保存中,可以減少肌肉細胞內冰晶的產(chǎn)生,可以保持肌球蛋白ATP酶的活性,從而提高冷凍肉類的品質和口感[39-40]。在羔羊屠宰前注射AFPG,宰后肉在–20℃凍藏2~16周后解凍檢測產(chǎn)品質量發(fā)現(xiàn):屠宰前注射AFPG均可顯著降低冰晶的體積和液滴的數(shù)量[41]。速凍果蔬容易出現(xiàn)汁液流失、軟爛、失去原有形態(tài)。運用基因工程的方法將異源高活性抗凍蛋白基因導入果蔬中,能夠有效改善這種狀況。美國DNA工程公司把抗凍蛋白基因導入番茄中,這種新的轉基因番茄耐寒性能增強,可以在–6℃生存幾個小時,而且果實冷藏后不變形[42]。

5抗凍蛋白在農(nóng)業(yè)中的應用研究

5.1抗凍蛋白轉基因技術提高動植物的耐寒能力。低溫冷害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個重要危害,每年因低溫冷害造成巨大的經(jīng)濟損失,提高動植物的耐寒能力是解決這一問題的關鍵。近年來,隨著轉基因技術的不斷成熟,抗凍蛋白基因被引入植物和動物物種,以擴大其地理適應范圍,增加低溫生存的能力。目前科學家已經(jīng)生產(chǎn)出多種能夠合成抗凍基因的轉基因物種,包括煙草,番茄和馬鈴薯植物等,初步觀察發(fā)現(xiàn)這些轉基因植物中獲得了增加的抗凍能力[43-44]。而表達外源AGFP的小鼠對于低溫引起的凍傷具有更好的抵抗力[45],同樣表達外源AGFP的果蠅也具有更強的低溫耐受能力[46]?？箖龅鞍邹D基因作物的推廣,將有效地幫助農(nóng)業(yè)生產(chǎn)避免惡劣天氣帶來的損失,擴展作物的栽種范圍和生長季節(jié),提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和質量。此外,抗凍蛋白轉基因農(nóng)作物還有望在后續(xù)的運輸、低溫儲藏和加工等多個環(huán)節(jié)更加有效和便利,抗凍蛋白在農(nóng)業(yè)和食品行業(yè)極具應用前景。5.2抗凍蛋白轉基因能有效提高水產(chǎn)經(jīng)濟魚類的耐寒能力。每年因低溫冷害造成的漁業(yè)損失巨大,將抗凍蛋白基因轉入溫度敏感經(jīng)濟魚類,可以提高這些魚類的抗寒能力,改善這些魚類的養(yǎng)殖區(qū)域。20世紀90年代,科學家發(fā)現(xiàn)將抗凍蛋白轉基因羅非魚顯示出增強的耐寒能力,但當時由于轉基因技術還不成熟,抗凍蛋白的表達水平比較低[47]。直接顯微注射南極魚抗凍蛋白到斑馬魚受精卵,斑馬魚發(fā)育成熟后表現(xiàn)出強的耐寒能力[29]。美國AquaBountyTechnologies公司擁有世界上首個被批準上市的轉基因魚,他們研發(fā)的轉基因三文魚AquAdvantage被轉入了兩種基因:太平洋奇努克三文魚的生長激素基因和大洋鱈的抗凍蛋白基因,使其可以在大西洋寒冷的底部也能快速持續(xù)生長[48]。由于來自極地魚類的抗凍蛋白屬于長期被人類食用的天然蛋白,在食品安全方面沒有問題,容易被大眾接受。

6南極魚抗凍蛋白研究和應用開發(fā)所存在的問題

盡管南極魚抗凍蛋白在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領域都有良好的應用前景,但是目前在生產(chǎn)成本和產(chǎn)業(yè)化等方面還存在一些限制和不足,生產(chǎn)僅限于研究和專門的應用。因此,如何低成本地生產(chǎn)高活性的抗凍蛋白是其應用開發(fā)的技術關鍵。目前有學者通過原核或真核表達系統(tǒng)成功表達和純化了重組的南極魚AFP[49-50],但上述研究仍停留在實驗室階段,有待于進一步提高表達量和規(guī)模化生產(chǎn)。此外,也有研究報道通過混合使用多種AFP或表達多種AFP的融合蛋白來增加AFPs與冰晶結合的能力,以提高AFP的熱滯活性[51]。AFP的應用開發(fā)需要解決以下幾個問題。首先,應建立AFP的基因工程產(chǎn)業(yè)體系,大規(guī)模生產(chǎn)AFP,降低其成本;其次,充分研究AFP在冷凍介質中的行為和作用機制。高濃度的冷凍劑,如DMSO、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等,可能使AFP不穩(wěn)定,甚至功能喪失;第三,應該設計和開發(fā)高活性的AFP,以克服天然AFPs的局限性。如有研究表明,含有三個結構域的AFPIII抗凍活性明顯高于一個和兩個結構域的AFPIII[52]。楊敏等[53]報道人工合成含有4個結構域的AFPIII抗凍蛋白(LD4)具有更強的抗凍、抗寒活性。LD4由4個AFPIII分子通過9個氨基酸的linker串聯(lián)而成,具有4個與冰晶結合的活性平面。LD4不僅具有抗凍功能,而且具有在非冰凍溫度下抵抗低溫傷害的抗寒功能,轉LD4基因的斑馬魚細胞可獲得強的耐寒特性。天然AFP無法穿透細胞膜,有報道進行細胞內化或穿透AFP的研發(fā),這樣有利于AFPs在組織、胚胎等的冷凍保存中更好地發(fā)揮作用,從而減少冷凍液中冷凍劑的使用量,提高冷凍保存的效率[20]。

總之,如何獲得大量的高效抗凍蛋白,降低抗凍蛋白的成本,是實現(xiàn)其廣泛應用的關鍵。

作者:張俊芳 陶筱帆 韓兵社 單位:上海海洋大學