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白斑綜合征(whitespotsyndrome，wSs)是全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)所面臨的危害性最大的病害之一，是國際獸醫(yī)局(OIE)規(guī)定需要報告的重要水生動物傳染病…。wss由白斑綜合征病毒(whitespotsyndromevims，WssV)引起，由于其給全世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害巨大，且到現(xiàn)在仍無有效控制措施，所以世界各國都給以重點關(guān)注【2-5J。綜合國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，針對對蝦體內(nèi)wsSV在養(yǎng)殖全程中動態(tài)變化的調(diào)查較少，而現(xiàn)有報道研究也存在采樣時間間隔較長，所體現(xiàn)的規(guī)律性不顯著，未能詳盡地反映其在整個養(yǎng)殖過程中的變動趨勢。本研究旨在通過利用實時定量PCR技術(shù)，對精養(yǎng)池塘凡納濱對蝦體內(nèi)wsSV攜帶情況進(jìn)行跟蹤，以期更有效和精確地反映對蝦體內(nèi)wssv攜帶量的變動規(guī)律，了解實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中影響WSSV流行的因素，從而增加對該疾病可控性的認(rèn)識，為預(yù)防養(yǎng)殖對蝦病毒病暴發(fā)提供理論依據(jù)和參考。

l材料與方法

1．1實驗場地選擇

2010年7月一2010年11月，在廣東省汕尾市紅海灣鴻泰養(yǎng)殖場，從10口凡納濱對蝦高位精養(yǎng)池塘中隨機(jī)抽取6口池塘進(jìn)行采樣。各池塘面積約為(0．45土0．1)hm2。池底鋪設(shè)土工膜，無泥沙層，水深1．8～2．2m，養(yǎng)殖用海水經(jīng)沙濾井過濾所得。每口池塘配備12～15kw／hm2的增氧設(shè)備(增氧機(jī)和底部增氧曝氣管)。放養(yǎng)凡納濱對蝦∞f^妒e刀口P螂1，口刀，z口mef)蝦苗體長(1．0士0．1)cm，放苗量為270萬尾／h“。

1．2材料及方法

1．2．1樣品采集采樣時間和頻率按照養(yǎng)殖時間劃分。在第一批放苗的五口池塘中隨機(jī)選取卜3號3口池塘。從放苗日起，跟蹤其養(yǎng)殖全程，時間從2010年7月31日到同年11月24日，約14d取一次樣，跟蹤時長116d。根據(jù)第一批的調(diào)查結(jié)果，在第二批放苗的5口池塘中隨機(jī)選取4—6號3口池塘從放苗后的第10天起，進(jìn)行養(yǎng)殖密集采樣跟蹤，時間從2010年9月18日到同年11月20日，采樣時間為7天1次，跟蹤時長63d。第二批采樣池塘均因wSS暴發(fā)而中斷養(yǎng)殖。所取蝦樣均為活蝦，每次每塘隨機(jī)采集對蝦不少于15尾，分別采集對蝦的鰓和肌肉組織，用濃度為75％的酒精固定。

1．2．2DNA的提取將每次采集的15尾對蝦隨機(jī)分成3組，每組5尾。任選一組，并分別取5尾蝦的鰓或者肌肉組織混合成一個樣品，鰓組織樣品總質(zhì)量為(15士2)mg，肌肉組織樣品總克數(shù)為(20土3)mg。各組織樣品DNA采用“天根海洋動物組織DNA提取試劑盒”(天根生物技術(shù)有限公司制造)提取。所提取的DNA樣于一20℃保存待測。

1．2．3Real．timePCR引物和探針引物和探針的選擇。根據(jù)DurandandLi曲tner【6J設(shè)計，由Invitrogen公司合成(表1)

1．2．4Real．timePcR反應(yīng)參照Li曲tIler等舊1建立的實時熒光定量PcR法檢測wSsV使用Eppendorf熒光定量PCR儀(EppendorfMastercy-clerRealplex)進(jìn)行定量PcR檢測。選取20“LPcR反應(yīng)體系：1O燦2xTaqManUniversalPCRMasterMix(TAKARA公司，代號DRR039A)，上下游引物各0．5燦(終濃度為10“m01／L)，探針0．5皿(終濃度為5“mol／L)，模板DNA2此，補(bǔ)充水至20此。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃30s；95℃5s，55℃15s，72℃30s，40個循環(huán)，每個樣品重復(fù)4次，每批樣品設(shè)置空白對照和陽性對照。空白對照用滅菌超純水作模板，陽性對照用已知病原蝦提取的DNA調(diào)整濃度后作模板。

1．2．5標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備根據(jù)Lightner[6]利用插入外源目的基因的方法得到純化陽性質(zhì)粒DNA，其濃度為1．618×108copy／此。用10倍稀釋陽性質(zhì)粒至7個梯度作模板并對其進(jìn)行擴(kuò)增，其平均CT值依次為34．90、31．04、27．65、24．57、20．24、17．11、13．66，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖l所示，R2=0．9991。

2結(jié)果與分析

2．1第一批放苗1～4池塘養(yǎng)殖全程對蝦攜帶wSSv檢測結(jié)果

2．1．114—34池塘對蝦鰓組織中WSSV攜帶量在養(yǎng)殖全程中，14—3”池塘對蝦鰓組織中wsSV攜帶量的動態(tài)變化如圖2所示。從圖中可以看出，3口池塘的對蝦苗種均攜帶wssv，且其攜帶量均達(dá)到了103copy幢以上。隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行，對蝦鰓組織中wssV的攜帶量整體呈現(xiàn)波動上升的趨勢。養(yǎng)殖前期上升幅度較小，最高攜帶量為1．o×105copy幢；到養(yǎng)殖60d左右，24、34池塘出現(xiàn)第一個波動高峰，此時鰓中wssV攜帶量最高可達(dá)到3．O×107c叩y／g。隨后其病毒攜帶量有所下降；到養(yǎng)殖后期，1”一3“池塘的wssv攜帶量均有較大幅度的上升，均在養(yǎng)殖末期達(dá)到最大峰值。養(yǎng)殖全程中，14池對蝦鰓組織wssv攜帶量的波動范圍為1．6×103—8．6×106c叩y恒，平均值1．1×106cdpy／g；2”池對蝦鰓組織wssV攜帶量的波動范圍為1．9×10’~2．1×107c叩y儋，平均值4．4×106copy悖；34池對蝦鰓組織wssv攜帶量的波動范圍為6．2×103～9．7×108copy／g，平均值1．1×108copy／g。

2．1．21L3”池塘對蝦肌肉組織中wsSv攜帶量在養(yǎng)殖全程中，1群一3j!j}池塘對蝦肌肉組織中wssV攜帶量如圖1所示，其動態(tài)變化情況與鰓組織中的趨勢相似，均呈現(xiàn)波動上升的趨勢，但整體低于鰓組織。結(jié)果顯示，14養(yǎng)殖池對蝦肌肉組織wssV攜帶量的波動范圍為1．3×103～4．4×105copy／g，平均值3．2×105copy／g；24養(yǎng)殖池對蝦肌肉組織wssV攜帶量的波動范圍為2．1×103～6．1×105copy／g，平均值2．8×105copy／g；34養(yǎng)殖池對蝦肌肉組織WssV攜帶量的波動范圍為6．5x103～1．1×106copy／g，平均值3．3×105copy／g。1虻38池塘病毒含量(取對蝦鰓和肌肉組織帶毒量的平均值)，環(huán)境指標(biāo)及養(yǎng)殖環(huán)境狀況見表2。

2．2第二批放苗4L64池塘加密采樣對蝦攜帶WSSv的檢測結(jié)果

2．2．14牝礦池塘對蝦鰓組織wSSV攜帶量44—6“池塘對蝦鰓組織WSSv攜帶量在養(yǎng)殖過程中的動態(tài)變化如圖2所示。從圖中可以看出，前期病毒攜帶量均較低，隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行，3個池塘對蝦鰓組織中wssv攜帶量逐漸升高，30d左右各池出現(xiàn)第一個波動高峰，wssV最高攜帶量為1．21×106copy／g，隨后有所穩(wěn)定和下降，但11月6日即養(yǎng)殖53d后，攜帶量快速增長。其中58池塘攜帶量在5天之內(nèi)從2．3×105copy儋升高至8．2×1010copy／g，最終暴發(fā)wss，導(dǎo)致中斷養(yǎng)殖，最后一次采樣缺失：44、64池對蝦wSSV攜帶量在后兩次采樣中迅速增加，最后一次采樣11月20日(即養(yǎng)殖63d)時均達(dá)到各池檢測的最大值(分別為6×106copy／g和5×107c叩y／g)，雖未達(dá)到發(fā)病閾值但兩池最終也因暴發(fā)wsS而于11月27—30日停止養(yǎng)殖。調(diào)查結(jié)果顯示，在整個養(yǎng)殖過程中，48池對蝦鰓組織wssv攜帶量的波動范圍為8．1×103～6×106copy／g，平均值8．6×105copy／g；5“養(yǎng)殖池對蝦鰓組織wSsV攜帶量的波動范圍為1．7×104～8．2×1010copy／g，平均值7．0×109copy／g；6”養(yǎng)殖池對蝦鰓組織wSsv攜帶量的波動范圍為5．7×103～5．0×107copy／g，平均值4．3×106copy／g。

2．2．24L6”池塘對蝦肌肉組織中WSSV攜帶量44—64池塘對蝦肌肉組織wSSv攜帶量在養(yǎng)殖過程中的動態(tài)變化如圖2所示，其變化情況與鰓組織的趨勢相似，均隨養(yǎng)殖時間的進(jìn)行逐漸波動上升，且無顯著性差異。調(diào)查結(jié)果顯示，4”池對蝦肌肉組織WSSV攜帶量的波動范圍為8．1×103～9．4×107copy／g，平均值1．1×1017copy／g；5“池對蝦肌肉組織wSsV攜帶量的波動范圍為1．7×104～1．2×1010copy／g，平均值1．1×109copy／g；6”池對蝦肌肉組織wSSv攜帶量的波動范圍為5．7×103～5．5×105copy／g，平均值1．1×10’copy／g。4牝64池塘病毒含量(取對蝦鰓與肌肉組織帶毒量的平均值)，環(huán)境指標(biāo)及養(yǎng)殖環(huán)境狀況見表3。3討論TaqMan探針法熒光定量PcR是實時熒光定量PCR(Real．timePCR)的一種，可以針對微量的病毒進(jìn)行檢測并實時監(jiān)測病毒的復(fù)制情況，其特異性更強(qiáng)，準(zhǔn)確度更高，被廣泛用于微量病毒復(fù)制的定量研究[7]。本研究采取實時定量PcR—TaqMan探針法，對高密度精養(yǎng)池塘對蝦wssV攜帶量進(jìn)行跟蹤調(diào)查，以期能夠更加準(zhǔn)確的了解對蝦養(yǎng)殖過程中體內(nèi)wssv攜帶量的變化。本次檢測結(jié)果表明，被測對蝦苗種攜帶微量wSSV范圍在1．3×103～1．7×104copy儋。蝦苗攜帶病原體，說明了苗種生產(chǎn)過程中的病害控制還需加強(qiáng)，對育苗場銷售的苗種病害監(jiān)控還需嚴(yán)格【8J。整個檢測結(jié)果表明，對蝦鰓組織中的wssV攜帶量整體多于肌肉組織，且兩者變動趨勢一致，但沒有顯著性差異(尸>0．05)。在對14—3“池塘整個養(yǎng)殖過程的調(diào)查中，wssV攜帶量在養(yǎng)殖前期(47d前)都有不同程度的增加，但均處于一個較穩(wěn)定的水平，wsSV拷貝數(shù)總體保持在104copy／g左右，個別值高于105copy／g；養(yǎng)殖中后期(60～116d)攜帶量呈現(xiàn)波動上升的趨勢，并在最后一次采樣中達(dá)到相對最大值。根據(jù)1“一34池塘中對蝦體內(nèi)wssv前期攜帶情況的調(diào)查，對第二批采樣的4虻64號3口池塘進(jìn)行密集采樣，縮短了采樣時間，增加了采樣次數(shù)，以期更好的反應(yīng)wssv的變化規(guī)律及其受各種環(huán)境因素影響所表現(xiàn)出的動態(tài)變化。在對4牝64池塘養(yǎng)殖的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，這3口池塘對蝦攜帶wssV的情況與1L38池塘較為相似，前期病毒含量有一定程度的上升，但均處于一個較穩(wěn)定的水平，除個別池塘外，wssv拷貝數(shù)多保持在105copy／g以下。然而53d后急劇上升，其中5”池塘升高至109copy／g以上，導(dǎo)致wSS暴發(fā)。44和64池塘也緊急收獲，致使養(yǎng)殖中斷。

探討本次調(diào)查檢測中發(fā)病池塘對蝦wssv攜帶量急劇上升并率先暴發(fā)wss的原因，筆者發(fā)現(xiàn)，池塘水體中浮游微藻及水體溫差變化大是主要原因。其中浮游微藻的種群結(jié)構(gòu)不良是重要因素；冬棚搭建后造成水體溫差變化大是主要誘因。有研究表明，良好的浮游微藻種群結(jié)構(gòu)可以提高對蝦養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，增強(qiáng)系統(tǒng)的抗干擾能力，有利于對蝦健康安全的生長【9。1…。對蝦疾病的暴發(fā)與水體中浮游微藻群落結(jié)構(gòu)的變化具有一定的相關(guān)性，蝦池中浮游微藻的種類和數(shù)量尤其是赤潮生物的類群和數(shù)量與對蝦發(fā)病的程度呈正相關(guān)，其多樣性指數(shù)與對蝦的發(fā)病程度呈負(fù)相關(guān)【11-”J。由表2、表3可知，在對以上各池塘的養(yǎng)殖環(huán)境指標(biāo)中浮游微藻種群結(jié)構(gòu)的檢測結(jié)果顯示：2一、3僦塘養(yǎng)殖初期均以赤潮藻為優(yōu)勢種，在凡亞比臺風(fēng)過境后的1周左右，24、34池塘均出現(xiàn)大量死蝦的情況，臺風(fēng)后的第一次采樣，對蝦體內(nèi)的病毒含量也出現(xiàn)急劇的升高。4牝64池塘養(yǎng)殖前中期的浮游微藻種類單一，且均以顫藻為優(yōu)勢種，當(dāng)池塘優(yōu)勢種由顫藻演替為其他藻類時，對蝦帶毒量均出現(xiàn)較大的波動。水溫也是影響wSSV復(fù)制的重要因素之一【14，l6I，搭建冬棚前后，養(yǎng)殖水體在短時間內(nèi)的最大溫差可達(dá)7℃，由原來的20℃左右升高到26℃左右，達(dá)到病毒復(fù)制的最佳溫度范圍。搭建冬棚后的采樣與之前采樣相比帶毒量有較大幅度的升高。所以筆者認(rèn)為，當(dāng)池塘浮游微藻群落結(jié)構(gòu)長期不良，尤其是以顫藻等赤潮藻長期作為優(yōu)勢種時，會致使對蝦免疫系統(tǒng)受到影響，使對蝦一直處于亞健康狀態(tài)，間接促進(jìn)了wssV在體內(nèi)的復(fù)制，而環(huán)境因素改變?nèi)缢疁卦谶m宜病毒復(fù)制的溫度范圍或冬棚的搭建使水溫在短時間內(nèi)變化較大。使得對蝦產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，抵抗力有所下降，從而誘發(fā)了病害的發(fā)生。

綜上所述，筆者認(rèn)為，對蝦可以在攜帶wSSV的情況下養(yǎng)殖生長，并成功上市，但前提是一個良好的養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的構(gòu)建和保持。降低或控制wssV的含量，使其低于發(fā)病閾值。影響wssV復(fù)制或暴發(fā)的關(guān)鍵因素有以下幾點：①對蝦免疫力的下降；②環(huán)境因子不穩(wěn)定和惡化，如鹽度突變，溫度突變或者長期處于病毒最佳復(fù)制溫度25～28℃之間、pH突變、氨氮和亞硝酸鹽濃度突變或長期處于高值范圍[15-161；③池塘水體中浮游微藻和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)不良[17]等。④對蝦養(yǎng)殖前中期是各種對蝦病暴發(fā)的關(guān)鍵時期，更應(yīng)注重對這些養(yǎng)殖時期對蝦抵抗力的增強(qiáng)。鑒于此，有效預(yù)防wSS病毒病的關(guān)鍵點在于生態(tài)防控：①構(gòu)建優(yōu)良的藻相，為對蝦生長提供適宜的環(huán)境，增強(qiáng)對蝦抵抗力，同時也可以減少不良藻相分泌的藻毒素等有害物質(zhì)對對蝦的傷害；②定期投放微生態(tài)制劑改良養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，如益生菌中芽孢桿菌的施放，有效調(diào)節(jié)池塘環(huán)境，利于對蝦生長[18_191；③針對臺風(fēng)暴雨等天氣，要提前積極做好預(yù)防工作，緩解臺風(fēng)暴雨給蝦體和養(yǎng)殖環(huán)境帶來的不良影響，如臺風(fēng)暴雨前后加強(qiáng)投放微生態(tài)制劑，維持良好浮游微藻和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)；④提高對蝦自身免疫力，如在飼料中增加Vc、葡聚糖和中草藥等物質(zhì)‘201；⑤采用混養(yǎng)模式‘211，增加捕食性動物，如少量混養(yǎng)羅非魚、石斑魚和蝦虎魚等兇猛魚類，可以捕食病弱對蝦，減少對蝦因殘食而導(dǎo)致的病害水平傳播?？傊?，筆者認(rèn)為應(yīng)對wss，防大于治，在本調(diào)查的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)并總結(jié)，在高位池對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中，藻相的優(yōu)劣直接或間接的影響著對蝦抵抗力的高低，同時反映了對蝦抗病能力的強(qiáng)弱。構(gòu)建良好的浮游微藻和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，保持養(yǎng)殖水體環(huán)境穩(wěn)定，可以最大程度的減少WSS暴發(fā)。