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【摘要】人類ermap基因是新近發(fā)現(xiàn)的編碼紅細(xì)胞膜相關(guān)蛋白基因，其功能可能與紅系造血活動(dòng)有關(guān)。為探討該基因在胎兒造血過程中的作用，收集9-36周難免流產(chǎn)胎兒共29例，分別抽提其肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦、骨髓和肌肉等9種臟器組織的RNA，取其中胎齡255周（25周過5天，下同）的胎兒各臟器組織的RNA進(jìn)行Northernblot檢測(cè)，了解人類ERMAP基因在胎兒臟器組織中的表達(dá)譜，同時(shí)采用熒光定量PCR（FQ-PCR）方法觀察該基因在不同胎齡胎兒組織中表達(dá)量的變化規(guī)律。結(jié)果Northernblot檢測(cè)顯示，人類ERMAP基因在255周胎兒肝臟和骨髓中表達(dá)陽(yáng)性，而在脾臟、腎臟、胸腺、心臟、肺臟、大腦及肌肉中表達(dá)陰性。FQ-PCR結(jié)果顯示，人類ERMAP基因在9-36周胎兒肝臟中均有表達(dá)，其表達(dá)量從第12周開始升高，18-20周達(dá)高峰，21周后逐漸下降；該基因在胎兒骨髓中的表達(dá)則從15周開始，27-32周達(dá)高峰，之后迅速下降，其表達(dá)量低于肝臟；在其余7個(gè)臟器中僅有部分標(biāo)本呈現(xiàn)低水平表達(dá)。結(jié)論：人類ERMAP基因在胎兒肝臟中的表達(dá)規(guī)律與胎兒肝臟造血過程基本一致，在15-32周胎兒骨髓中的表達(dá)規(guī)律與胎兒期骨髓造血活動(dòng)基本吻合，推測(cè)該基因的功能可能與胎兒發(fā)育過程中紅系細(xì)胞向肝臟和骨髓的遷移活動(dòng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】ERMAP基因；胎兒期；肝臟；骨髓；造血

ExpressionofHumanERMAPGeneinFetalTissues

AbstractHumanERMAP(hERMAP)isanovelgenecodingforerythroidmembrane-associatedprotein,whichmayplayaroleinerythropoiesis.ToexploretheroleofhERMAPinfetalhematopoiesis,29fetusesofinevitableabortionwiththefetalagesof9-36weekswerecollected,andthetotalRNAswereisolatedfromtheliver,spleen,kidney,heart,lung,thymus,brain,bonemarrowandskeletalmuscle,theRNAsfromwhichat255weekfetalagewereusedtodetecthERMAPexpressionsindifferentfetaltissueswithNorthernblot,andthehERMAPinvariousfetaltissueswerequantifiedbyFQ-PCR.Asaresult,NorthernblotshowedthathERMAPwasexpressedinliverandbonemarrowat255fetalage,butnotintheotherorgantissues.FQ-PCRresultsindicatedthatthehERMAPhadbeenstillexpressedin9-36thweekfetalliver,increasedstartingfrom12th-week,reachingapeakbetween18-20thweekanddecliningslowlystartingfrom21st-week.Inthefetalbonemarrow,expressionofthehERMAPbeganfrom15thweek,reachedahighestlevelbetween27-32ndweekandfellrapidlyfrom33rdweek,theexpressionlevelofwhichwaslowerthanthatinliver.Thelowlevelexpressionofthisgenewasobservedinsomespecimensofkidney,heart,lung,thymus,brainandskeletalmuscle.ItisconcludedthattheexpressionofhERMAPinfetalliverapproximatelyconsistentwithhaematopoiesisoffetalliver,andtheexpressionofthisgeneinbonemarrowaged15-32thfetalweekscoincideswithhaematopoiesisoffetalbonemarrow.ItsuggeststhatthefunctionofthehERMAPispossiblyrelatedwiththemigrationoferythroidcellstoliverandbonemarrowduringthefetaldevelopmentprocess.

KeywordshumanERMAP；fetalstage；haematopoiesis

近年來(lái)，Ye等［1-3］分別從鼠胚胎紅細(xì)胞和人胎肝cDNA文庫(kù)中篩選出編碼紅細(xì)胞膜相關(guān)蛋白（erythroidmembrane-associatedprotein，ERMAP）基因，并證實(shí)其高度特異表達(dá)于胎肝、成人骨髓等造血組織以及K562和HEL細(xì)胞系，其編碼的蛋白分子定位于網(wǎng)織紅細(xì)胞和原始紅細(xì)胞膜、293T細(xì)胞膜和其他胞漿小體上，分析顯示其為一跨膜蛋白分子，屬免疫球蛋白超家族成員。推測(cè)ERMAP可能通過細(xì)胞間的黏附和（或）識(shí)別，影響紅系造血，或在紅系相關(guān)性疾病、自身免疫性疾病和其他疾病中起一定

作用。目前關(guān)于該基因的特性與功能尚待進(jìn)一步研究。本研究旨在通過觀察人類ERMAP基因在不同胎齡胎兒各臟器組織中的表達(dá)譜及表達(dá)量的變化，探討該基因在胎兒造血過程中的作用。

材料和方法

材料

收集2004年3月至2004年11月由廣東省婦幼保健院、廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院、東山區(qū)婦幼保健院、海珠區(qū)婦幼保健院等醫(yī)院婦產(chǎn)科提供的難免流產(chǎn)胎兒，胎齡不限。均排除胎兒先天畸形、孕母遺傳性疾病、妊娠期間用藥史。胎兒離開母體后立即取肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦、骨髓和肌肉9種臟器組織，放入凍存管，置于-80℃冰箱保存。

方法

總RNA的提取稱取50-100mg組織置于研缽中，加入液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至含1mlRNA-solv的離心管中，按照RNA-sol試劑（Omega公司產(chǎn)品）說明書提取RNA，置于-80℃保存。用紫外透射燈(Amersham公司產(chǎn)品)分析其純度，要求OD260/OD280值在1.8-2.0。提取物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)為完整RNA。

ERMAP基因表達(dá)譜的Northernblot觀察選取1個(gè)胎齡為255周(25周過5天）的胎兒，將上述9種臟器組織的總RNA在1%瓊脂糖凝膠上甲醛變性電泳3小時(shí)（5V/cm），在紫外分光光度儀下測(cè)量18S、28S條帶到點(diǎn)樣孔的距離，利用真空轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)膜2小時(shí)。然后以PCR方法分別標(biāo)記ERMAP和β-actin探針（按照PCRDIGProbeSynthesisKit試劑盒說明書操作，引物由北京賽白盛有限公司合成），ERMAP引物序列為5′-GAGATGGCGAGTTCTGCT-3′，5′-CACCGTCCTCCCCTTATA-3′，β-actin引物序列為5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′。對(duì)照管加入無(wú)DIG標(biāo)記的dNTPs。探針變性后進(jìn)行預(yù)雜交及雜交，經(jīng)過低嚴(yán)謹(jǐn)性和高嚴(yán)謹(jǐn)性洗膜后，加入Anti-Digoxigenin-AP孵育30分鐘，再加入CDP-Star顯色劑于尼龍膜上，將膜曝露在化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)System-genome公司產(chǎn)品）中檢測(cè)熒光信號(hào)。

ERMAP基因表達(dá)量的FQ-PCR檢測(cè)［5］取各臟器組織的總RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA（反應(yīng)體系參照Promega公司試劑說明）。將已測(cè)定濃度的含有ERMAP基因cDNA序列的pBluescriptSK質(zhì)粒（加拿大McMaster大學(xué)病理與分子醫(yī)學(xué)系Dr.DavidChui教授贈(zèng)送）依次10倍稀釋成7個(gè)濃度級(jí)梯度作為模板，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。取同一樣品的等量cDNA作為PCR模板，分別加入ERMAP及β-actin的引物、探針以及TaqManUniversalPCRMasterMix（美國(guó)ABI公司產(chǎn)品），檢測(cè)ERMAP及β-actin的表達(dá)水平，兩者之比即為ERMAP在各組織中的相對(duì)表達(dá)量。ERMAP和β-actin引物與MGB探針由上海基康有限公司合成，序列如下：ERMAPprimer1：5′-CATGTGACGGAGGTGGACAA-3′ERMAPprimer2：5′-CAGCTTTATGGAGTTTTCCTTTTTCT-3′ERMAPMGBprobe：FAM-CTTCTTTCAGACCATGCTA-MGBβ-actinprimer1：5′-ACGGCCAGGTCATCACCAT-3′β-actinprimer2：5′-AAGGCTGGAAGAGTGCCTCAG-3′。β-actinMGBprobe：FAM-CAATGAGCGGTTCCG-MGB。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

基因的相對(duì)表達(dá)量以±SD表示，采用OriginPro7.5軟件進(jìn)行資料分析和繪圖。

結(jié)果

人類ERMAP基因在胎兒臟器組織中的表達(dá)譜

Northernblot顯示肝臟和骨髓表達(dá)陽(yáng)性，而脾臟、腎臟、胸腺、心臟、肺臟、大腦及肌肉等表達(dá)陰性（圖1）。

胎肝組織RNA以ERMAP探針雜交后，其陽(yáng)性條帶到點(diǎn)樣孔距離為4.04cm，推算出目的基因的mRNA長(zhǎng)度為3.6kb，與人類ERMAPmRNA長(zhǎng)度一致。

人類ERMAP基因在不同胎齡胎兒組織中表達(dá)量的變化

FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線將已測(cè)定濃度的含有ERMAP基因cDNA的質(zhì)粒pBluescriptSK依次10倍稀釋成108-102cps/μl等7個(gè)濃度梯度，經(jīng)FQ-PCR后獲得典型的倒“S”型曲線，可檢測(cè)到熒光信號(hào)的起始循環(huán)數(shù)（Ct）與模板濃度對(duì)數(shù)值的相關(guān)函數(shù)為У=－3.557Ct38.152，r2=0.998178。

人類ERMAP基因在胎兒肝臟和骨髓中的表達(dá)量ERMAP基因在9-36周胎兒肝臟中均有表達(dá)，其表達(dá)量從第12周開始升高，18-20周達(dá)高峰，21周后逐漸下降。ERMAP基因在胎兒骨髓中的表達(dá)則從15周開始，27-32周達(dá)高峰，之后迅速下降，各階段的表達(dá)量均低于肝臟（附表，圖2）。Table.ExpressionofERMAPinfetalliverandbonemarrowatdifferentfetalages（略）

人類ERMAP基因在胎兒其它臟器中的表達(dá)量檢測(cè)脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦及肌肉7種臟器各17個(gè)標(biāo)本，結(jié)果顯示ERMAP基因僅在部分標(biāo)本中低水平表達(dá)，其表達(dá)的陽(yáng)性率（即各臟器陽(yáng)性例數(shù)與總例數(shù)之比）分別為20%、7.6%、25%、13%、20%、7.6%和25%。

討論

人類胚胎期造血經(jīng)歷了卵黃囊造血、肝脾造血和骨髓造血等造血部位的遷移過程。卵黃囊造血始于妊娠第3周，終止于第8周。在妊娠第5周肝臟發(fā)育成完善的血竇系統(tǒng)，造血干細(xì)胞（hemotopoieticstemcells，HSC）隨血流遷移并種植于肝臟，進(jìn)入了胎肝造血期。隨著胚胎的不斷發(fā)育，胎肝來(lái)源的HSC不斷遷移至骨髓血管外基質(zhì)，在骨髓腔中分化成熟，形成骨髓造血。骨髓造血一直持續(xù)至出生后，成為終身的造血器官。除了遷移至骨髓外，胎肝的HSC還可遷移、定植于脾臟、胸腺和淋巴結(jié)，并在其中開始造血活動(dòng)。在整個(gè)胚胎造血過程中，各器官的造血活動(dòng)是連續(xù)不斷、此消彼長(zhǎng)的。但是期間的調(diào)控機(jī)理如何，至今尚未闡明。越來(lái)越多的研究表明，某一器官的造血能力主要取決于其造血微環(huán)境，當(dāng)一個(gè)器官的微環(huán)境不再適合造血活動(dòng)時(shí)，其中的造血干細(xì)胞便隨血液流向其它組織，與其中的成分相互作用，從而啟動(dòng)造血細(xì)胞的增殖與分化，最后形成新的造血中心［4］。造血細(xì)胞的遷移和定植是由造血細(xì)胞表面的一系列黏附分子與造血微環(huán)境中相應(yīng)的配體結(jié)合后所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果［6］，這種黏附分子與相應(yīng)配體相互作用，在造血細(xì)胞增殖和分化過程中同樣發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。造血微環(huán)境中的黏附分子及其配體，與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等共同形成造血調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子基礎(chǔ)。紅系造血細(xì)胞發(fā)育過程的不同階段，其細(xì)胞膜表面的黏附分子的表達(dá)呈現(xiàn)一定的時(shí)空規(guī)律［7］。hERMAP基因編碼紅細(xì)胞跨膜蛋白，為一黏附分子，屬免疫球蛋白超家族成員。Xu等［3］證實(shí)，hERMAP基因表達(dá)于第12周和23周的胎肝紅細(xì)胞、成人骨髓，以及第8-12周臍帶血中的網(wǎng)織紅細(xì)胞和原始紅細(xì)胞，提示該基因在胚胎紅系造血中可能起到一定的作用。但Xu的研究?jī)H為定性研究，且未對(duì)該基因在胚胎臟器中的表達(dá)量作連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察。本研究在本課題組建立的hERMAP基因FQ-PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上［5］，對(duì)hERMAP基因在不同胎齡器官組織中的表達(dá)量進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。結(jié)果顯示，該基因在妊娠9-36周胎兒肝臟中均有表達(dá)，其表達(dá)規(guī)律與胎兒肝臟造血過程基本一致。該基因在胎兒骨髓中的表達(dá)則始于15周，30-32周達(dá)高峰，這與胎兒期骨髓造血活動(dòng)基本吻合，但妊娠32周后骨髓造血活動(dòng)仍然存，而hERMAP基因的表達(dá)卻迅速下降。由附表和圖2可見，在妊娠15-17周，hERMAP在胎肝的表達(dá)量出現(xiàn)較為明顯的下降，我們認(rèn)為這可能與粒系細(xì)胞的生成有關(guān)。早期胎肝所產(chǎn)生的幾乎全部是幼稚紅細(xì)胞，妊娠3-4個(gè)月胎兒紅細(xì)胞約為109/L，妊娠4個(gè)月左右胎肝開始有明顯的粒細(xì)胞生成。而在此階段，胎肝所生成的紅細(xì)胞數(shù)量并無(wú)明顯的增加。由于本研究的檢測(cè)結(jié)果是以hERMAP與β-actin的表達(dá)量之比表示的，反映的是hERMAP在各組織中的相對(duì)表達(dá)量。因此，在妊娠15-17周，hERMAP在胎肝的相對(duì)表達(dá)量下降，之后胎肝造血進(jìn)入旺盛階段，紅系造血明顯活躍，紅細(xì)胞數(shù)量可達(dá)1011/L，hERMAP的表達(dá)量出現(xiàn)高峰，直到21周后隨著肝臟造血活動(dòng)減弱而逐漸下降［8］。由上述結(jié)果推測(cè)，人類ERMAP基因的功能可能與胎兒發(fā)育過程中紅系細(xì)胞向肝臟和骨髓的遷移活動(dòng)有關(guān)，在肝臟造血后期以及妊娠后期，大量造血細(xì)胞向肝臟和骨髓的遷移活動(dòng)基本完成，其基質(zhì)內(nèi)的ERMAP配體數(shù)量下降，ERMAP基因的表達(dá)水平也隨之下降；但ERMAP蛋白與其配體作用的機(jī)制如何，其是否參與了胚胎紅系造血細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控，仍有待下進(jìn)一步的研究證實(shí)。研究結(jié)果還顯示，該基因在胎兒脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦及肌肉等臟器組織中的表達(dá)水平較低或不恒定。取胎齡255周的胎兒臟器進(jìn)行Northernblot檢測(cè)也同樣證實(shí)了該基因主要表達(dá)于胎肝及骨髓組織，而在其它臟器組織中表達(dá)陰性，推測(cè)可能與下列因素有關(guān)：①在胚胎造血過程中，雖然卵黃囊、胎肝或骨髓的HSC可遷移、定植于脾臟、胸腺，但其產(chǎn)生的造血細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)不如胎肝和骨髓［9］，所以ERMAP基因的表達(dá)量較低；②腎臟、心臟、肺臟、大腦及肌肉不是造血器官，缺乏ERMAP的特異性配體，但由于胎兒血液中含有一定數(shù)量的HSC，在這些器官或組織中亦可以檢測(cè)到ERMAP的低水平表達(dá)，但并不恒定。遺憾的是，由于取材條件所限，本研究未能觀察到hERMAP在妊娠9周以前以及36周以后的表達(dá)情況，因此未能對(duì)胚胎發(fā)育全過程的ERMAP基因表達(dá)規(guī)律作更全面的動(dòng)態(tài)研究。

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