導(dǎo)語(yǔ)：阿托伐他汀治療腦脊髓炎研究一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

作者：潘滿冬,譚利明,盧偉,黃繼義

【摘要】目的探討阿托伐他汀對(duì)Wistar大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的治療作用。方法建立Wistar大鼠EAE模型,給予不同劑量阿托伐他汀處理,觀察大鼠發(fā)病程度、病理改變及血清白細(xì)胞介素4(IL4)、干擾素γ(IFNγ)水平的變化。結(jié)果阿托伐他汀可減輕大鼠發(fā)病程度,減少炎性病灶數(shù),降低血清IFNγ水平升高幅度,使血清IL4水平在發(fā)病初期即升高,高劑量阿托伐他汀作用更顯著。結(jié)論阿托伐他汀在一定程度上可有效干預(yù)大鼠EAE發(fā)病,并呈劑量相關(guān)性,其機(jī)制可能與改變Th1/Th2類細(xì)胞因子比值有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】吡咯類;腦脊髓類;自身免疫性,實(shí)驗(yàn)性;腦脊髓炎;白細(xì)胞介素4;干擾素Ⅱ型

ABSTRACT:ObjectiveThisstudywasdesignedtoexploretheeffectsofatorvastatin,aninhibitorofHMGCoAreductaseontheexperimentalautoimmuneencephalomyelitis(EAE)inWistarrats.MethodsAtorvastatinwasadministeredattwodifferentdosestoWistarratsEAEmodel.Ascaleof0-5accordingtothesymptomsscoredtheseverityofEAE.Thenumbersofinflammationlesioninthebrainandspinalcordwerecountedbyopticalmicroscopy.Theserumlevelsofinterferonγandinterleukin4weredeterminedbyenzymelinkedimmunosorbentassay.ResultsComparedtotheuntreatedgroup,theatorvastatingroupsonlypartiallydevelopedEAEwithalighterdegreeofmalfunction.Thenumbersofinflammationlesionreducedsignificantlyinatorvastatintreatedgroups.TheserumlevelofinterferonγincreasedinatovarstatintreatedgroupswiththedevelopmentofEAE,butwaslowerthanthatintheuntreatedgroup.Theserumlevelsofinterleukin4inatorvastatingroupswerehigherattheonset.HigherdoseatorvastatinshowedbetterprotectionagainstEAEdevelopment.ConclusionToacertainextentatorvastatincouldeffectivelyameliorateEAEinrats.Theeffectswereinadosedependentfashion,whichmightbemechanisticallyrelatedtothebalancebetweenTh1/Th2cytokines.

KEYWORDS:experimentalautoimmuneencephalomyelitis;atorvastatin;IL4;IFNγ

多發(fā)性硬化(multiplesclerosis,MS)是一種由免疫細(xì)胞介導(dǎo)攻擊中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘為特征的自身免疫性疾病,好發(fā)于青壯年,是青壯年人群致殘的常見疾病之一。目前臨床上經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療MS的藥物有:β干擾素(IFNβ)、格拉默(Glatirameracetate)和米托蒽醌(Mitoxantrone)等。這些藥物作用有限,且有非腸道給藥、價(jià)格昂貴、不良反應(yīng)發(fā)生率高等缺點(diǎn),故有必要尋找新的更安全有效的治療藥物。他汀類藥物主要用于降脂治療,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有獨(dú)立于降脂作用的免疫調(diào)節(jié)作用的多效性[1]。筆者研究阿托伐他汀對(duì)人MS的經(jīng)典動(dòng)物模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)模型的影響,探討其在EAE中的可能作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1主要材料白細(xì)胞介素4（IL4）和IFNγELISA試劑盒(北京晶美生物工程有限公司);阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司);豚鼠和雌性Wistar大鼠[湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng):許可證號(hào)SCXK(湘)20030003],8～10周齡,體質(zhì)量180～220g。

1.2動(dòng)物健康雌性Wistar大鼠60只,隨機(jī)分成4組:對(duì)照組，EAE組(蒸餾水灌胃),阿托伐他汀干預(yù)一組(阿托伐他汀1mg·kg-1·d-1)和阿托伐他汀干預(yù)二組(阿托伐他汀10mg·kg-1·d-1)。每組再隨機(jī)分成3小組,每小組各5只,分別自免疫接種日開始灌胃至第8,11,17天。

1.3免疫原乳劑的制備及模型的建立參照文獻(xiàn)[23]法,取體質(zhì)量300～400g豚鼠處死后,在無(wú)菌操作下,迅速剝出脊髓,制成50%(M/V)的豚鼠脊髓勻漿,再與等量的完全福氏佐劑(含6mg/mL卡介苗)充分混合,制成免疫原乳劑。大鼠兩后足墊內(nèi)各注射等量免疫原乳劑(共計(jì)100g/0.2mL),同時(shí)尾根皮下注射百日咳疫苗(5.8×1010mL-1)0.2mL。對(duì)照組免疫原乳劑中的豚鼠脊髓勻漿用等量的生理鹽水代替,余同其他組。

大鼠免疫接種后每日稱體質(zhì)量,觀察病情并進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分。神經(jīng)功能障礙評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用5分評(píng)分法[4]:0分,無(wú)明顯異常;1分,大鼠尾部無(wú)力麻痹;2分,尾部無(wú)力+后肢無(wú)力;3分,后肢輕度麻痹;4分,后肢嚴(yán)重麻痹伴前肢無(wú)力,被動(dòng)翻身不能復(fù)原;5分,全身癱瘓或?yàn)l臨死亡。

1.4血清中IL4和IFNγ水平檢測(cè)各組3小組分別于免疫接種后第8,11,17天(相當(dāng)于EAE組發(fā)病初期、高峰期和緩解期),通過(guò)摘除眼球取全血1.5mL,離心后獲得血清于-20℃冰箱保存待檢。用ELISA法檢測(cè)IL4和IFNγ水平。

1.5病理檢查取各組中免疫接種后第11天(相當(dāng)于EAE組發(fā)病高峰期)的大鼠各5只,斷頭處死后,剝?nèi)∧X和脊髓用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋。取大腦頂葉、小腦腦干及腰髓切片,進(jìn)行常規(guī)HE染色和Weil’s髓鞘染色。光鏡下按呈袖套樣改變或超過(guò)15～20個(gè)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)者稱為1個(gè)炎性灶進(jìn)行病灶計(jì)數(shù),將各節(jié)段病灶數(shù)相加后取均數(shù),進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用x±s表示。成組設(shè)計(jì)多個(gè)樣本均數(shù)比較用方差分析,組間均數(shù)比較用LSDt檢驗(yàn)。發(fā)病率比較用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1動(dòng)物發(fā)病情況EAE組大鼠在致敏后約7～10d陸續(xù)出現(xiàn)活動(dòng)減少,體質(zhì)量減輕,尾部麻痹,雙后肢癱瘓,嚴(yán)重者四肢癱瘓,伴大小便失禁,甚至出現(xiàn)瀕死狀態(tài)。整個(gè)病程持續(xù)8～10d,發(fā)病率100%。對(duì)照組均無(wú)發(fā)病。阿托伐他汀干預(yù)一組和干預(yù)二組發(fā)病率分別為60%和40%,其中干預(yù)二組與EAE組比較,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩干預(yù)組平均發(fā)病潛伏期相對(duì)EAE組延后1～2d,臨床癥狀相對(duì)較輕,尤以發(fā)病高峰期干預(yù)組和EAE組比較臨床癥狀明顯減輕(表1,圖1)。

表1EAE組和干預(yù)組各期臨床神經(jīng)功能障礙評(píng)分（略）

Tab1Theclinicalscoresatdifferentperiods

EAE：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎.與EAE組同期比較,☆:P<0.05;與干預(yù)一組同期比較,＃:P<0.05.

圖1實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病大鼠（略）

Fig1Aratindiseasestate

2.2血清細(xì)胞因子的變化與對(duì)照組比較,EAE組血清IFNγ水平在發(fā)病初期即升高,并隨病情加重進(jìn)一步升高,到免疫接種后第11天臨床神經(jīng)功能評(píng)分達(dá)高峰時(shí),IFNγ水平亦達(dá)到高峰,而血清IL4水平在發(fā)病緩解期升高。阿托伐他汀干預(yù)組血清IFNγ水平也出現(xiàn)升高,但升高幅度顯著低于EAE組,而血清IL4水平在發(fā)病初期即出現(xiàn)升高,在緩解期更明顯。IFNγ水平升高的降低程度和IL4水平的升高程度,隨著藥物劑量增加而更加明顯(圖2)。

2.3病理觀察EAE組腦和脊髓內(nèi)小血管尤其是A:對(duì)照組;B:EAE組;C:干預(yù)一組;D:干預(yù)二組.與對(duì)照組同期比較,☆:P<0.01;與EAE組同期比較,△:P<0.05;與干預(yù)一組同期比較,＃:P<0.01.

圖2大鼠血清IFNγ和IL4水平（略）

Fig2TheserumlevelsofIFNγandIL4

小靜脈周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),血管袖套樣改變。浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞類型以淋巴細(xì)胞為主,亦可見膠質(zhì)細(xì)胞和一定數(shù)量的巨噬細(xì)胞,伴有海馬錐體細(xì)胞和脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性。對(duì)照組無(wú)病理改變。阿托伐他汀干預(yù)組可見類似EAE組病理改變(圖3)。EAE組、阿托伐他汀干預(yù)一組和干預(yù)二組的病灶數(shù)分別為(11.96±1.83),(5.25±0.98)和(3.16±0.94)。兩干預(yù)組病灶數(shù)較EAE組明顯減少(P<0.01),尤以干預(yù)二組為甚(與干預(yù)一組比較,P<0.05)。而在Weil’s髓鞘染色中,僅EAE組少數(shù)大鼠在腦干和小腦白質(zhì)內(nèi)可見片狀脫髓鞘,對(duì)照組與藥物干預(yù)組均未發(fā)現(xiàn)明顯脫髓鞘改變。

3討論

3.1EAE模型血清IFNγ、IL4變化特點(diǎn)EAE是一種獲得性髓鞘脫失的動(dòng)物模型,在臨床、病理等方面與MS極其相似,是MS的經(jīng)典動(dòng)物模型[5]。本實(shí)驗(yàn)在建立Wistar大鼠EAE模型基礎(chǔ)上,觀察不同劑量的阿托伐他汀對(duì)EAE大鼠的治療作用。

MS和EAE是細(xì)胞免疫與體液免疫均參與的錯(cuò)綜復(fù)雜疾病,但以細(xì)胞免疫為主[6]。而CD4+Th細(xì)胞是主要參與的免疫應(yīng)答細(xì)胞,根據(jù)生成細(xì)胞因子的不同,CD4+Th細(xì)胞又可分為Th1和Th2兩個(gè)亞群。Th1類細(xì)胞因子主要有IL1、IL2、IL12、TNFα和IFNγ等;Th2類細(xì)胞因子主要有IL4、IL5和IL10等。在正常情況下,Th1/Th2細(xì)胞因子互相拮抗處于動(dòng)態(tài)平衡,使機(jī)體處于免疫穩(wěn)定狀態(tài);病理情況時(shí),兩者平衡被打破,Th1細(xì)胞因子水平上升,Th2細(xì)胞因子水平下降,則導(dǎo)致細(xì)胞免疫介導(dǎo)的炎性疾病發(fā)生。

A:EAE組小腦內(nèi)小血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn);B:阿托伐他汀干預(yù)一組小腦小血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn);C:阿托伐他汀干預(yù)二組小腦內(nèi)小血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn);D:EAE組海馬顆粒細(xì)胞變性;E:EAE組腦干內(nèi)脫髓鞘病灶.EAE：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎.A～D:HE染色×100.E:Weil’s染色×100.

圖3EAE組和阿托伐他汀干預(yù)組大鼠病理改變（略）

Fig3ThepathologicchangsinEAEgroupandatorvastatintreatedgroups

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)大鼠血清中細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示,EAE組血清IFNγ水平在發(fā)病初期即出現(xiàn)升高,在發(fā)病高峰期亦達(dá)到高峰,隨著病情緩解而下降;與對(duì)照組相比,其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且,血清IFNγ水平的變化趨勢(shì)與大鼠神經(jīng)功能障礙評(píng)分、病理改變中的炎性病灶數(shù)目變化趨勢(shì)相同,提示IFNγ參與了大鼠EAE的發(fā)生和發(fā)展,呈促進(jìn)炎癥作用。而EAE組血清IL4水平早期輕度下降,與對(duì)照組相比無(wú)差異性;在病情緩解期出現(xiàn)升高,與對(duì)照組相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),此與Begolka等發(fā)現(xiàn)到EAE病情緩解期才能檢測(cè)到IL4mRNA的表達(dá)相吻合[7],說(shuō)明IL4參與疾病的緩解過(guò)程,起到抑制炎癥作用。

3.2阿托伐他汀對(duì)EAE模型具有一定干預(yù)治療作用他汀類藥物是一種3羥基3甲基戊二酰輔酶A(HMGCoA)還原酶抑制劑,是當(dāng)前調(diào)脂藥物中最有效的一類藥物。近年來(lái)其非降脂作用屢見報(bào)道[1]。他汀類藥物非降脂作用的可能機(jī)制是通過(guò)抑制HMGCoA還原酶,阻斷甲羥戊酸下游中間產(chǎn)物的產(chǎn)生,包括焦磷酸法呢酯(FPP)、焦磷酸牻牛兒基牻牛兒基酯(GGPP)等類異戊二烯化合物,進(jìn)而阻斷Ras、Rho、Rac等蛋白的異戊二烯化,影響細(xì)胞的增殖、分化和遷移作用[8]。

阿托伐他汀是他汀類藥物中安全性能最好的藥物之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干預(yù)組與模型組相比發(fā)病率明顯下降,發(fā)病日相對(duì)推后,病情嚴(yán)重程度明顯下降,病理檢查所示病灶數(shù)也顯著減少,顯示阿托伐他汀具有干預(yù)治療大鼠EAE作用。血清標(biāo)志性的細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明這種干預(yù)治療作用可能與阿托伐他汀下調(diào)IFNγ的促炎作用及上調(diào)IL4的抑炎作用相關(guān)。其可能機(jī)制是:阿托伐他汀降低IFNγ分泌,減少抗原遞呈細(xì)胞(APC)上MHCⅠ、MHCⅡ類分子的表達(dá),阻斷抗原遞呈作用,降低外周T淋巴細(xì)胞的激活;亦減少血管內(nèi)皮細(xì)胞上粘附分子的表達(dá),阻斷T淋巴細(xì)胞通過(guò)血腦屏障,使中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)及組織破壞減輕[1]。同時(shí)阿托伐他汀增加IL4分泌,而IL4可通過(guò)增加T細(xì)胞IL4受體的表達(dá),并與受體結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(STAT6),誘導(dǎo)Th2類細(xì)胞因子相關(guān)基因的表達(dá),從而增加Th2細(xì)胞的效應(yīng)[9]。

參考Nath等的研究報(bào)道[10],本實(shí)驗(yàn)中血清細(xì)胞因子變化機(jī)制可能是:阿托伐他汀通過(guò)抑制NFκΒ和Tbet(T盒子轉(zhuǎn)錄分子)的表達(dá),并阻斷JAKSTAT4通道,從而阻斷Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化,減少Th1類細(xì)胞因子(IFNγ、TNFα)的分泌有關(guān);另一方面,阿托伐他汀誘導(dǎo)GATA3(IL4的主要調(diào)控子)的表達(dá)和STAT6磷酸化,促使Th0向Th2細(xì)胞分化,增加Th2類細(xì)胞因子(IL4、IL5、IL10)分泌。實(shí)驗(yàn)中兩不同劑量組比較,高劑量組(10mg·kg-1·d-1)的神經(jīng)功能障礙評(píng)分、病理檢查中病灶數(shù)、血清IFNγ水平升高的幅度均顯著低于小劑量組(1mg·kg-1·d-1),而血清IL4水平升高的幅度顯著高于小劑量組,提示在一定范圍內(nèi)阿托伐他汀劑量越大,干預(yù)治療作用越明顯。

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