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【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌ImmuneresponsesandprotectiveefficacyinducedinmicebyMycobacteriumtuberculosisMPT64ESAT6fusionprotein【Abstract】AIM:ToevaluatehumoralandcellmediatedimmuneresponsesbyMPT64andESAT6fusionproteinsandtotestprotectiveefficacyagainstMycobacteriumtuberculosis(MTB)challenge.METHODS:BALB/cmicewereimmunized3timesat2weekintervalsubcutaneouslyonthebackwithfusionproteinMPT64ESAT6.Inthespleenlymphocytesofimmunizedmicestimulationindex(SI)wasmeasuredbyMTTmethodandthelevelofsecretedIFNγwasdetectedbyELISA.SomeofvaccinatedBALB/cmicebyfusionproteinswereintravenouslyinfectedwith1×105CFUMTBstrainH37Rv.Fourweekslater，bacterialloadinspleenswasdetermined.RESULTS:ThetiterofseraspecificantibodyinBALB/cmiceimmunizedwithfusionexpressionproteinMPT64ESAT6was1∶1500.TheSIoflymphocytesinfusionproteinimmunizedgroupwas2.23,significantlyhigherthanthatofsalineimmunizedgroup(0.88).TheIFNγlevelinculturesupernatantofspleenlymphocytesfromthemiceimmunizedwithfusionproteinswere(4.28±0.27)μg/L,significantlyhigherthanthatofsalineimmunizedgroup［(0.48±0.17)μg/L,P<0.05］,butlowerthanthatofBacillusCalmetteGuerin(BCG)immunizedgroup［(5.18±0.31)μg/L］.Comparedwithsalineimmunizedmice（bacterialloadwas6.45±0.17）,dramaticreductionswereobservedforMTBreplicationinthespleenfromBALB/cmiceimmunizedwithfusionproteins(bacterialoadwas5.04±0.11)followingasubsequentchallenge,buttheprotectiveefficacyinmiceimmunizedwithMPT64ESAT6wasnotasgoodasthatofBCGimmunizedgroup(bacterialloadwas4.38±0.22).CONCLUSION:MPT64andESAT6fusionproteinscouldbeusedasanovelcomponentofthenewTBvaccine.【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis；vaccine；MPT64；ESAT6；fusionexpression【摘要】目的：測(cè)定MPT64與ESAT6融合蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及保護(hù)力.方法：將MPT64與ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次，每次間隔2wk，ELISA測(cè)定免疫小鼠血清特異性抗體的滴度.最后一次免疫完成后4wk，分離部分免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞，MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，ELISA檢測(cè)懸液中IFNγ水平.另一部分免疫的BALB/c小鼠經(jīng)尾靜脈感染MTB毒株H37Rv，4wk后計(jì)數(shù)脾臟細(xì)菌負(fù)荷數(shù).結(jié)果：MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特異性抗體滴度1∶1500，免疫小鼠后淋巴細(xì)胞刺激增殖指數(shù)為2.23，而生理鹽水免疫組只有0.88；脾淋巴細(xì)胞懸液中誘發(fā)的IFNγ為（4.28±0.27）μg/L，顯著高于生理鹽水免疫組［（0.48±0.17）μg/L，P<0.05］，但不及BCG免疫組［（5.18±0.31）μg/L］.與生理鹽水免疫組（細(xì)菌負(fù)荷6.45±0.17）相比較，融合蛋白免疫的小鼠，對(duì)攻擊感染后抗MTB在脾臟中增殖有顯著作用，細(xì)菌負(fù)荷為5.04±0.11，但與BCG免疫組相比脾臟細(xì)菌負(fù)荷減少甚微（細(xì)菌負(fù)荷4.38±0.22）.結(jié)論：MPT64與ESAT6融合蛋白可作為新型結(jié)核疫苗的候選組分.【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌；疫苗；MPT64；ESAT6；融合表達(dá)0引言ESAT6（Mr6000的早期分泌蛋白）和MPT64是結(jié)核分支桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）中重要的保護(hù)性抗原,編碼這兩種蛋白的基因只存在于MTB毒株中而卡介苗（BacillusCalmetteGuerin,BCG）中缺失［1］，研究發(fā)現(xiàn)重組的MPT64和ESAT6蛋白免疫小鼠后均可有效抵抗MTB感染.本研究在成功獲得MPT64與ESAT6融合蛋白的基礎(chǔ)上［2］，研究該融合蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平和對(duì)MTB毒株H37Rv攻擊的保護(hù)力.1材料和方法1.1材料MTB毒株H37Rv由陜西省結(jié)核病防治研究所王瑞副主任技師惠贈(zèng)；卡介苗疫苗株由蘭州生物制品研究所出品（國(guó)藥準(zhǔn)字SF20010035，批號(hào)20011201）；鼠IFNγ和ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自晶美公司；潮霉素（GIBCOBRL公司）.BCG培養(yǎng)增強(qiáng)劑（albumindextrosecatalaseADC）和RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自GIBCO公司.7H9液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Difco公司；改良羅氏培養(yǎng)基由本室自制，MTB的培養(yǎng)濾液蛋白(culturefiltrateproteins,CFP)由本室制備.羊抗鼠IgGHRP購(gòu)自華美生物公司.6~8周齡BALB/c小鼠，雌性，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心感染實(shí)驗(yàn)室.1.2方法1.2.1MTB毒株H37Rv的培養(yǎng)和定量取羅氏培養(yǎng)基中保存的MTB毒株H37Rv接種到7H9培養(yǎng)基（含100g/LADC和0.5g/LTween80），37℃振搖培養(yǎng)3wk，5000r/min離心10min，收集細(xì)菌，保存于-20℃?zhèn)溆?用7H9液體培養(yǎng)基系列稀釋濃縮液，接種于羅氏培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2wk，計(jì)數(shù)濃縮液細(xì)菌的CFU.1.2.2BCG的培養(yǎng)和定量取BCG疫苗株接種到7H9液體培養(yǎng)基（含100g/LADC和0.5g/LTween80），相同方法培養(yǎng)、收集BCG，并計(jì)數(shù)細(xì)菌的菌落形成單位（colonyformingunits,CFU）.1.2.3融合蛋白的大量制備取MPT64pProEXHTESAT6陽(yáng)性克?。?］，活化后分別接種到1000mLLB培養(yǎng)液中，37℃振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，IPTG誘導(dǎo)，集菌，先進(jìn)行SDSPAGE，采用Invitrogen的NiNTA純化試劑盒純化目的蛋白，分光光度法測(cè)定蛋白濃度.1.2.4免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為3組，每組10只小鼠，一組用MPT64ESAT6融合蛋白免疫BALB/c小鼠；免疫劑量均為1mg/只，共免疫3次，第一次和第二次免疫加有不完全福氏佐劑，第三次單純免疫融合蛋白，每次間隔2wk，免疫結(jié)束后，收集小鼠血清，用CFP作為抗原，ELISA測(cè)定免疫小鼠血清特異性抗體滴度,其余兩組分別為BCG和生理鹽水對(duì)照組.最后一次免疫結(jié)束后4wk，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：每組取5只小鼠，用于測(cè)定淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(stimulationindex,SI)和IFNγ水平；其余5只用于毒株攻擊實(shí)驗(yàn).1.2.5脾臟淋巴細(xì)胞的分離與制備將免疫的小鼠斷頸處死，無(wú)菌取脾臟，置于平皿內(nèi)200目的鋼網(wǎng)上，用注射器針芯研磨，并加入RPMI1640培養(yǎng)液沖洗.將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入2倍體積的淋巴細(xì)胞分離液，1000r/min離心20min.吸取中間單核細(xì)胞層，用RPIM1640液洗滌兩次后計(jì)數(shù).1.2.6特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將分離的淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整至5×108/L，在96孔板中用100mL/LFCS的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，200μL/孔，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組每孔加入25μLMTBCFP（25mg/L溶于PBS，本室制備），對(duì)照組不加CFP，調(diào)零孔不加脾細(xì)胞，37℃50mL/LCO2孵箱培養(yǎng)68h后，每孔加20μLMTT（5g/L，溶于PBS，pH7.2，過(guò)濾除菌），繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清，加DMSO150μL/孔，振蕩10min，測(cè)定A490nm值.結(jié)果用刺激指數(shù)SI=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值表示.1.2.7IFNγ的誘生及含量的測(cè)定5×109/L脾細(xì)胞在24孔板用含10mL/LFCS的RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，800μL/孔，同時(shí)加入MTBCFP100μL/孔，37℃50mL/LCO2孵箱培養(yǎng)72h，收集培養(yǎng)液，5000r/min離心5min，取上清，-20℃凍存?zhèn)錂z.參照試劑盒說(shuō)明（夾心ELISA法）測(cè)定各標(biāo)本所含IFNγ濃度.1.2.8MTB毒株H37Rv的攻擊實(shí)驗(yàn)最后一次免疫完成后4wk，用MTB毒株H37Rv經(jīng)尾靜脈感染小鼠，劑量為105CFU/只，4[1][2]wk后，斷頸處死小鼠，脾臟勻漿，計(jì)數(shù)細(xì)菌CFU.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1小鼠體內(nèi)特異性抗體滴度MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠三次后血清特異性抗體滴度平均值為1∶1500.2.2抗原特異性脾臟淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分離免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞，在體外用CFP抗原刺激，測(cè)定了淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，與生理鹽水對(duì)照組（SI為0.88）相比較融合蛋白MPT64ESAT6免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖明顯，SI為2.23，BCG免疫組SI為3.58，高于融合蛋白免疫組.2.3脾臟淋巴細(xì)胞中誘生的IFNγ水平MPT64ESAT6免疫的小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液，體外用CFP刺激，其懸液IFNγ含量分別為（4.28±0.27）μg/L，與生理鹽水對(duì)照組（0.48±0.17)μg/L相比較有明顯增加（P<0.05），但不及BCG免疫組［（5.18±0.31）μg/L,P<0.05］（圖1）.2.4免疫小鼠對(duì)MTB毒株攻擊時(shí)的抵抗作用免疫完成后4wk，H37Rv經(jīng)尾靜脈感染BALB/c小鼠，4wk后計(jì)數(shù)脾臟細(xì)菌負(fù)荷數(shù)，與生理鹽水免疫組（細(xì)菌負(fù)荷數(shù)6.45±0.17）相比較，融合蛋白MPT64ESAT6免疫的BALB/c小鼠，對(duì)攻擊感染后抗MTB在脾臟中增殖有顯著作用（細(xì)菌負(fù)荷數(shù)分別為5.04±0.11），但與BCG免疫組（細(xì)菌負(fù)荷數(shù)為4.38±0.22）相比較脾臟細(xì)菌負(fù)荷減少甚微.aP<0.05vs生理鹽水.n=5.圖1融合蛋白在小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中誘生的IFNγ水平（略）3討論卡介苗（BCG）是目前唯一的預(yù)防結(jié)核病疫苗，但其對(duì)成年人結(jié)核病的預(yù)防效果不穩(wěn)定，保護(hù)力常發(fā)生變化（0~80%）［3］，因此，研制全面有效的新疫苗是控制結(jié)核病的重要途徑.融合亞單位疫苗具有成分明確，使用安全，可減少純化步驟等優(yōu)點(diǎn)而受到國(guó)內(nèi)外的重視.目前已知的保護(hù)性抗原有MTB早期分泌蛋白Ag85B復(fù)合物、ESAT6和MPT64［4］等，選擇這幾種抗原制備的亞單位疫苗可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性免疫應(yīng)答，并不受先前接觸分枝桿菌的影響.單個(gè)蛋白構(gòu)成的亞單位疫苗產(chǎn)生的特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答是針對(duì)每一組分抗原的，機(jī)體獲得的免疫保護(hù)力有限，因此新型TB疫苗著重于融合多個(gè)免疫表位［5］.本研究中將純化的MPT64與ESAT6融合蛋白，免疫小鼠，特異性抗體滴度可達(dá)到1∶1500，顯著高于已報(bào)道文獻(xiàn)［6］中抗體的滴度，融合蛋白免疫三次后，小鼠特異性淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)顯著升高，說(shuō)明淋巴細(xì)胞被有效活化.IFNγ常被認(rèn)為是抵抗MTB感染的一個(gè)關(guān)鍵性細(xì)胞因子，也是Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)，TB的保護(hù)性效應(yīng)與分泌IFNγ的淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生密切相關(guān).融合蛋白MPT64ESAT6免疫小鼠誘生的IFNγ水平顯著高于生理鹽水對(duì)照組（P<0.05），提示這兩種融合基因可能是TB疫苗中理想的候選基因.MTB毒株攻擊實(shí)驗(yàn)中，與生理鹽水組相比較，MPT64ESAT6免疫組使得細(xì)菌數(shù)由6.45±0.17降為5.04±0.11，有效控制了MTB的感染，但與BCG免疫組相比免疫保護(hù)力還是有一定差距.研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用結(jié)核桿菌短期培養(yǎng)液中分離純化的分泌型蛋白免疫動(dòng)物，只會(huì)產(chǎn)生很弱的免疫應(yīng)答，亞單位疫苗必須配以適宜的佐劑多次接種才能達(dá)到效果［7］，在本研究中，采用不完全福氏佐劑具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，可刺激產(chǎn)生IL2，IFNγ和IL12，是本室較常用的一種免疫策略.MPT64ESAT6融合蛋白誘導(dǎo)的保護(hù)力有限，分析原因可能是因?yàn)楸Ｗo(hù)性抗原種類不多，難以誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛而全面的細(xì)胞免疫應(yīng)答；同時(shí)蛋白質(zhì)在體內(nèi)的滯留時(shí)間短并且其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間也較短，需選擇合適的劑量［8］，多次免疫才能達(dá)到有效的保護(hù)水平.【參考文獻(xiàn)】［1］KamathAT,FengCG,MacdonaldM,etal.DifferentialprotectiveefficacyofDNAvaccinesexpressingsecretedproteinsofMycobacteriumtuberculosis［J］.InfectImmun,1999,67(4):1702-1707.［2］師長(zhǎng)宏,王曉武,生,等.結(jié)核分枝桿菌差異蛋白MPT64與ESAT6的融合表達(dá)與純化［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,26(20):1840-1842.［3］范雄林,徐志凱,李元,等.結(jié)核分枝桿菌Ag85B成熟蛋白基因免疫［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,22(14):1283-1287.［4］DohertyTM,AndersenP.Tuberculosisvaccinedevelopment［J］.CurrOpinPulmMed,2002,8(3):183-187.［5］師長(zhǎng)宏,范雄林,徐志凱,等.結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Ag85BESAT6的融合表達(dá)及純化［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志,2004,(2):89-92.［6］薛瑩,李元,史皆然,等.結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Ag85B的免疫學(xué)特性［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,23(13):1203-1205.［7］LangermansJA,DohertyTM,VervenneRA,etal.ProtectionofmacaquesagainstMycobacteriumtuberculosisinfectionbyasubunitvaccinebasedonafusionproteinofantigen85BandESAT6［J］.Vaccine,2005,23(21):2740-2750.［8］DietrichJ,AagaardC,LeahR,etal.ExchangingESAT6withTB10.4inanAg85Bfusionmoleculebasedtuberculosissubunitvaccine:EfficientprotectionandESAT6basedsensitivemonitoringofvaccineefficacy［J］.JImmunol,2005,174(10):6332-6339