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【關(guān)鍵詞】缺血預(yù)處理EffectsofrenalischemicpreconditioningontheexpressionsofBcl2,Bax,Fasproteinsinimmaturemyocardialcellsinrabbits【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectsofrenalischemicpreconditioning(RIP)onapoptosisandexpressionsofBcl2,BaxandFasproteinsinimmaturemyocardialcellsinrabbits.METHODS:Isolatedworkingrabbitheartmodelwasusedinthisstudyand24immaturerabbitswererandomlydividedintocontrolgroup,ischemia/reperfusion(I/R)groupandRIPgroup.TheTUNEL,nucleosomalladderofDNAfragmentsandtheexpressionofBcl2,BaxandFasproteinsweredetected.RESULTS:ComparedwiththatinI/Rgroup,TUNELcellapoptosiswaslower［(4.19±1.13)%vs(12.30±2.10)%,P<0.01］,ladderofDNAfragmentswaslower(57350±1765vs135200±3370,P<0.01),Bcl2expressionwashigher(33525±1026vs12385±860,P<0.01),Baxexpressionwaslower(8640±768vs32472±1128,P<0.01)andFasexpressionwaslower(8936±912vs32100±1260,P<0.01)inRIPgroup.CONCLUSION:RIPdecreasesimmaturemyocardialcellapoptosisandaffectstheexpressionsofBcl2,BaxandFasproteins.【Keywords】kidney;ischemicpreconditioning;apoptosis;Bcl2;Bax;Fas【摘要】目的：探討腎缺血預(yù)處理(RIP)對兔未成熟心肌細(xì)胞凋亡和Bcl2,Bax,Fas蛋白表達(dá)的影響.方法：24只幼兔采用Langendorff離體心臟灌注模型，隨機(jī)分為正常對照組（C）、心臟缺血/再灌注組(I/R)和腎缺血預(yù)處理組(RIP)，每組8只，測定各組未成熟心肌細(xì)胞凋亡和Bcl2,Bax,Fas蛋白表達(dá).結(jié)果：RIP組與I/R組比較，心肌細(xì)胞凋亡率明顯減少［(4.19±1.13)%vs（12.30±2.10）%,P<0.01］，DN段梯光密度明顯減少(57350±1765vs135200±3370,P<0.01),Bcl2表達(dá)增多(33525±1026vs12385±860,P<0.01),Bax(8640±768vs32472±1128,P<0.01)和Fas(8936±912vs32100±1260,P<0.01)表達(dá)明顯減少.結(jié)論：RIP可減少缺血再灌注后兔未成熟心肌細(xì)胞凋亡和影響B(tài)cl2,Bax,Fas蛋白的表達(dá).【關(guān)鍵詞】腎；缺血預(yù)處理；細(xì)胞凋亡；Bcl2；Bax；Fas0引言實(shí)驗(yàn)表明，成熟心肌和心肌外的組織器官缺血預(yù)處理可減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其中Bcl2,Bax,Fas等基因蛋白的表達(dá)在細(xì)胞凋亡中起重要作用.腎缺血預(yù)處理(renalischemicpreconditioning,RIP)對未成熟心肌細(xì)胞凋亡是否有影響的報道甚少.本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察RIP對兔未成熟心肌細(xì)胞凋亡和Bcl2,Bax,Fas等基因蛋白表達(dá)的影響.1材料和方法1.1材料出生14～21d的健康長耳大白兔24只(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物室提供)，雌雄不拘.MPIAS1000型多媒體病理圖像分析系統(tǒng)（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院清平影像工程公司生產(chǎn)）進(jìn)行光密度測定.細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司.1.2方法1.2.1模型建立及分組按處理方式不同將動物隨機(jī)分為3組,每組8只.開胸，右心耳注入肝素(300U/kg)，切開主動脈插入灌注管，即行KH液Langendorff灌流，灌注壓為6kPa(45.0mmHg).切取心臟，結(jié)扎肺靜脈，剪開左心耳將內(nèi)徑3mm左房灌注管插入左房，內(nèi)徑1mm測壓管插入左心室.左房灌注壓為1kPa(7.5mmHg)，左心后負(fù)荷為3.0kPa(22.5mmHg).KH緩沖液成分(mmol/L):NaCl118.50,KCl4.70,CaCl22.50,MgSO41.20,NaHCO325.00,KH2PO41.20,Glucose11.10,Na2EDTA0.50.使用時新鮮配制，經(jīng)0.45μm濾器過濾，灌流前給予體積分?jǐn)?shù)為950mL/LO2和50mL/LCO2混合氣體按1.5L/min向儲液瓶內(nèi)的灌流液中通氣30min，灌流液維持在37℃，pH為7.4，滲透壓為824~850kPa/L［320~330mosm/L,1mosm=2.5787kPa(37℃)］.①正常對照組（C）:僅灌注KH液180min，然后取心肌標(biāo)本.②缺血/再灌注組(I/R)：灌注20min后，停灌45min，復(fù)灌120min.③腎缺血預(yù)處理組(RIP)：反復(fù)2次阻斷腎血流5min/放開5min，建立Langendorff模型，然后重復(fù)I/R組缺血/再灌注方法.1.2.2觀察指標(biāo)①凋亡細(xì)胞原位標(biāo)記與半定量分析：左心室心肌組織常規(guī)石蠟包埋，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)帶熒光的deuridinetriphosphate(dUTP)缺口末端標(biāo)記法(terminaltransferaseUTPnickendlabeling,TUNEL)［1］，標(biāo)記凋亡細(xì)胞核中DNA3′OH末端，經(jīng)脫蠟，洗脫，消化，孵育，洗脫，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察.根據(jù)凋亡陽性細(xì)胞分布情況，每張切片拍攝5個陽性視野，每視野計數(shù)300個心肌細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，以平均計算陽性細(xì)胞所占的百分比作為凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)(AI).②瓊脂糖凝膠電泳檢測DN段梯：采用快速法檢測DN段梯［2］.③Bcl2,Bax,Fas基因蛋白的表達(dá)：采用WesternBlot法.用2×SDS樣品緩沖液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白質(zhì)，經(jīng)SDSPAGE分離后迅速轉(zhuǎn)移至尼龍膜，按文獻(xiàn)［3］法加入單抗(1∶1000)及堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG(1∶1000)用BCIP/NBT顯色.應(yīng)用MPIAS1000型多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量測定A值.統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果2.1凋亡細(xì)胞原位標(biāo)記與半定量分析RIP組的細(xì)胞凋亡率為(4.19±1.13)%，與I/R組的(12.30±2.10)%比較P<0.01(Fig1).2.2瓊脂糖凝膠電泳檢測DN段梯DN段梯光密度測定RIP組(57350±1765)與I/R組(135200±3370)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).2.3Bcl2,Bax,Fas蛋白的表達(dá)密度測定Bcl2蛋白RIP組(33525±1026)與I/R組(12385±860)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Bax蛋白RIP組(8640±768)與I/R組(32472±1128)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Fas蛋白RIP組(8936±912)與I/R組(32100±1260)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).3討論缺血再灌注損傷可誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［4］，細(xì)胞凋亡已成為再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中一個重要環(huán)節(jié).通過干預(yù)凋亡基因的表達(dá)阻斷細(xì)胞凋亡以減輕再灌注損傷的研究是近年來細(xì)胞分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)之一.近年來研究認(rèn)為心肌缺血預(yù)處理可減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生［5］.心肌缺血預(yù)處理是通過PKC的信號傳遞來保護(hù)心肌的，PKC和mitoKATP與凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)連，從而影響心肌的細(xì)胞凋亡［6］，而RIP的心肌保護(hù)作用亦與PKC和mitoKATP相關(guān).Bcl2主要表達(dá)于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，其表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，Bax表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡.細(xì)胞凋亡是一種受促凋亡基因如fas和抗凋亡基因如bcl2調(diào)控的主動性細(xì)胞死亡過程.Fas屬于TNF受體家族.由Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡存在于多種細(xì)胞系中.心肌細(xì)胞膜表達(dá)功能性的Fas和FasL，但是在正常情況下Fas和FasL并不介導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡.我們通過建立Langendorff灌注模型檢驗(yàn)了RIP對兔未成熟心肌細(xì)胞凋亡及Bcl2,Bax,Fas基因蛋白表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)RIP使缺血再灌注后兔未成熟心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，Bcl2基因蛋白的表達(dá)明顯增多，而Bax,Fas基因蛋白的表達(dá)明顯減少，說明在兔未成熟心肌，RIP可通過影響B(tài)cl2,Bax,Fas基因蛋白的表達(dá)而減少心肌細(xì)胞凋亡.【參考文獻(xiàn)】［1］GavrieliY,ShermanY,BenSassonSA.IndentificationofprogrammedcelldeathinsituviaspecificlabelingofnuclearDNAfragmentation［J］.JCellBiol,1992;1[1][2]19:493-501.［2］姜泊.分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，1996：177.［3］SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.Molecularcloning:Alaboratorymanual［M］.2nded.NewYork:ColdSpringHarborLaboratory.1989:1860-1874.［4］GottliebRA,BurlesonKO,KlonerRA,etal.Reperfusioninjuryinducesapopto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