導語：藥物設計學課程教學案例設計研究一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

[摘要]在藥學本科生的藥物設計學課程中，以細菌RNA聚合酶抑制劑的虛擬篩選為例，利用AutoDockvina軟件對小分子化合物庫進行分子對接虛擬篩選，用PyMOL和LigPlot軟件進行結果分析。該教學案例的設計可以幫助學生理解基于分子對接的藥物虛擬篩選方法，認識小分子抑制劑與靶蛋白的作用機制，幫助學生更好理解藥物分子設計，有效調動學生的學習積極性，達到了提高教學質量的目的。

[關鍵詞]教學改革；分子對接；AutoDockvina軟件；虛擬篩選；藥物化學

藥物設計是藥物化學的重要研究內容，藥物設計主要基于經(jīng)典的藥物化學原理、生物大分子的結構信息和已知化合物的結構信息，構建具有藥理活性的小分子化合物，旨在提供候選藥物，為創(chuàng)新藥物的研究提供物質基礎。藥物設計學課程的目標是讓藥學本科生掌握藥物分子設計的基本原理、研究內容和研究方法，建立藥物分子設計的思路和理念[1]。分子對接(MolecularDocking)是兩個或多個分子之間通過幾何匹配和能量匹配而相互識別的過程[2-3]。分子對接在藥物分子設計中具有十分重要的意義。分子對接也是藥物虛擬篩選的一種常用方法，通過分子對接可以從化合物庫中篩選出潛在的活性先導化合物，也可以揭示藥物小分子和生物靶點之間的相互作用方式，預測化合物的親和力及活性，也可以用于先導化合物的結構優(yōu)化等[4]。目前，多重耐藥菌以及耐藥菌感染引發(fā)的死亡等問題已成為全球關注的醫(yī)學與社會問題，嚴重地威脅著感染性疾病的治療，為此迫切需要能夠抵抗多重耐藥菌的具有新結構與新作用機制的抗菌藥物[5-6]。而細菌RNA聚合酶已成為最熱門的一類抗菌藥物靶標，開發(fā)其相應的抑制劑克服已有抗生素的耐藥性具有重要的意義[7]。分子對接作為藥物設計學課程中主要內容，既是學習的重點也是難點。筆者根據(jù)多年從事新型抗菌藥物的研究經(jīng)歷，結合科研工作實踐，在桂林醫(yī)學院藥學專業(yè)的藥物設計學課程的教學案例中，以“虛擬篩選細菌RNA聚合酶抑制劑”作為教學切入點，以AutoDockvina、PyMOL和LigPlot等藥物設計軟件來進行虛擬篩選，通過自建的小型化合物庫，虛擬篩選細菌RNA聚合酶抑制劑。本案例的設計目的是讓學生熟悉如何從數(shù)據(jù)庫選擇合適的靶點作為研究對象，化合物庫的構建，蛋白及小分子的預處理，以及AutoDockvina的對接流程，PyMOL和LigPlot的作圖方法等，激發(fā)學生的學習興趣，了解和熟練掌握通過虛擬篩選的手段從化合物庫中發(fā)現(xiàn)新型活性先導化合物的方法。

1教學案例的設計

1.1軟件介紹

AutoDock是由美國Scripps研究所的OIson小組開發(fā)的分子對接軟件包[8-9]。AutoDock程序目前最新的版本為4.2.6。AutoDockvina是一個開源的分子對接程序[10]，最初由OlegTrott博士在Scripps研究所的分子圖形實驗室設計和開發(fā)的。AutoDockvina與AutoDock相比，前者大大提高了準確性，而且AutoDockvina可以利用系統(tǒng)上的多個CPU或CPU內核來顯著縮短運行時間。AutoDockvina是目前最為廣泛使用的虛擬篩選軟件之一。PyMOL是一款經(jīng)典的三維分子結構顯示軟件[11-12]。PyMOL已廣泛應用于正式發(fā)表的科學研究文獻中的三維分子結構顯示。本教學案例使用的PyMOL版本為1.7.4。LigPlot是一款針對學術用戶的軟件[13]，是免費、開源二維的結構顯示軟件，可自動生成二維配體-蛋白質相互作用圖，最新版本是LigPlot+v2.2，能夠鏈接到PyMOL軟件。1.2AutoDock分子對接方法的建立1.2.1小分子化合物庫的建立在本次教學案例中，首先安排學生在課前進行化合物庫的建立。從文獻中收集具有抗菌活性的中藥單體化合物，先使用ChemDraw軟件繪制出單體化合物的結構，再用Caculations-MM2-MinimizeEnergy模塊對小分子化合物進行能量優(yōu)化，并保存成mol2格式。用raccoon軟件將mol2格式批量轉換為pdbqt格式，創(chuàng)建一個包含5個化合物(化合物1-5)的小型數(shù)據(jù)庫。1.2.2蛋白的預處理從PDB數(shù)據(jù)庫獲取細菌RNA聚合酶三維結構(PDBID：3DXJ)。利用PyMOL1.7.4軟件，保留蛋白的C和D鏈，除去其他鏈，除去水分子(保留D鏈的H2O1539)，除去金屬離子，將處理好的蛋白保存為3dxjp.pdb。在AutoDock4.2軟件中，將3dxjp.pdb添加氫原子，計算電荷，設置原子類型為AssignAD4type，并保存為3dxjp.pdbqt格式。1.2.3配體小分子的預處理利用PyMOL軟件，從蛋白晶體復合物中提取出共晶配體NE6，并保存為NE6.pdb格式。將NE6.pdb在Chem3DPro14.0中使用MM2力場進行構象優(yōu)化，保存為pdb格式。在AutoDockTools中的Ligand模塊打開此配體，在Ligand模塊中選擇ChooseTorsions彈出的TorsionCount對話框，并保存為NE6.pdbqt文件。1.2.4設置Grid參數(shù)打開3dxjp.pdbqt和NE6.pdbqt，設置Grid參數(shù)，以蛋白的活性位點(centerx=-11.5，centery=58.49，centerz=4.587)為中心；設置x=50，y=50，z=50，xyz分別表示在各方向上的格點的數(shù)量；Spacing設置為0.375?，設置完成后保存為grid.gpf文件。1.2.5設置Docking參數(shù)在AutoDockTools中的Docking模塊打開保存好的兩個pdbqt文件，SearchParameters選擇遺傳算法(GeneticAlgorithm)，NumberofGARuns設置為10，MaximumNumberofevals設置為250000，其他參數(shù)為默認，輸出文件保存為dock.dpf文件。1.2.6執(zhí)行運算圖1對接配體和共晶配體OLF的構象對比圖，綠色為對接配體，紫色為共晶配體OLFFig.1Conformationofthedockedligandandco-crystallizedligand.Thegreenrepresentedthedockedligand,andpurplerepresentedco-crystallizedligandOLF在鍵盤運行win+R，輸入cmd命令，使用cd命令進入工作文件夾。輸入autogrid4-grid.gpf-lgrid.glg運行程序，輸出grid.glg文件。再輸入autodock4-pdock.dpf-ldock.dlg，輸出dock.dlg文件。在AutoDockTools的Analyze板塊中對dlg格式文件進行分析，保存最優(yōu)構象。為檢查Autodock4.2參數(shù)設置的合理性，將共晶配體NE6與蛋白3DXJ按上述參數(shù)設置進行分子對接，然后把對接前后的NE6的結構相比較。在VMD1.9.3軟件中，對NE6和保存的最優(yōu)構象計算均方根偏差(RMSD)值，如果RMSD值＜2?，說明建立的分子對接模型可靠性較高。也可以利用PyMOL軟件比較對接前后的共晶配體的構象(圖1)，如果疊合度很高，也能說明對接模型的可靠性較高。

1.3AutoDockvina虛擬篩選

根據(jù)以上建立的分子對接模型，將對接參數(shù)寫進AutoDockvina的配置文件conf.txt，這個文件里面寫上用于對接的詳細參數(shù)。然后通過win+R進入運行窗口，輸入“cmd”進入命令行窗口，進入AutoDockvina工作文件夾。輸入“vina--configconf.txt”，回車，運行該程序完成對接的虛擬篩選。所得對接結果如表1所示。結果顯示，化合物4與靶標蛋白3DXJ的親和力(Affinity=-9.8kcal/mol)最強，而其他化合物對靶標的親和力較弱(＞-7.0kcal/mol)。

1.4虛擬篩選結果分析

本教學案例中，我們利用PyMOL和LigPlot軟件這2種經(jīng)典的分子結構顯示軟件，分析預測得到的活性最強的化合物4與靶標蛋白的相互作用模式。通過PyMOL的外部GUI窗口(ExternalGUI)File-Open打開AutoDock對接后產(chǎn)生的dlg文件，然后打開純蛋白文件3dxyp.pdb文件，點擊PyMOL的all，選擇A(Action)＞preset＞ligandssites＞cartoon。蛋白3DXJ與化合物的4三維作用模式如圖2A所示。打開LigPlot程序，點擊File＞OpenPDBFile打開在PyMOL處理好的蛋白和最優(yōu)構象的復合物pdb文件，并顯示成2D作用模式圖(圖2B)。對接結果顯示Ser1084、Gln1019、Gly620、Leu618等關鍵氨基酸分別與化合物4上與氮原子直接相連的羰基、羥基及六元環(huán)上氧原子存在氫鍵相互作用；而其他氨基酸如Val1466、Trp1038、Val1037、Glu1034、Leu619、Asn617、Lys621、Ile1467等與該化合物有疏水作用。

2教學效果及學生反饋

在實際的教學中，學生對受體蛋白的預處理和對接過程會遇到一些困難，老師會重點解答同學們的以下幾個疑問：(1)為什么要對受體蛋白進行加氫處理？蛋白晶體復合物結構中通常會缺少氫原子的坐標，而氫原子尤其是極性氫原子對計算靜電作用是必須的。因此，在利用AutoDock進行對接時，需要給蛋白加上氫原子，也可以利用PyMOL軟件來快速完成這個操作，依次點選Edit-Hydrogen-Add-Polaronly，加上的氫原子會以白色短線形式出現(xiàn)。(2)可以通過幾種途徑來準備配體小分子？①利用ChemDraw軟件準備配體小分子。如果是未有文獻報道的小分子化合物，先在ChemDraw2D畫好結構式，然后復制到ChemDraw3D做能量優(yōu)化。能量優(yōu)化步驟：Caculations-MM2-minimizeenergy-Run，然后File-Saveas-SYBYL2(*.mol2)，留待在AutoDock中進一步處理備用。②利用PubChem數(shù)據(jù)庫下載復雜分子。如果是已知的化合物，尤其一些結構比較復雜的分子，例如細菌RNA聚合酶抑制劑利福霉素(Rifamycin)，如果我們還是用ChemDraw2D來畫結構式，會很容易畫錯，所以建議大家直接登錄PubChem數(shù)據(jù)庫下載2D或者3D結構。那么怎樣選擇一個合適的蛋白作為研究對象呢？在實際的課堂教學中，我們一般會建議學生基于如下條件選取晶體結構：解析度盡可能高、盡可能未有氨基酸殘基缺失或突變、優(yōu)先選擇人源、有文獻報道的且?guī)в泄簿潴w的復合物晶體等?？傊?，我們建議同學們在不知道怎么選蛋白作為研究對象的情況下，就多看文獻找思路。(3)如何在分子模擬水平上驗證分子對接結果的可靠性？如果已經(jīng)有明確的共晶配體分子的晶體復合物作為研究對象，我們在建立分子對接模型用于虛擬篩選之前，必須進行晶體復合物重現(xiàn)性研究，即Re-dock研究。也就是要用復合物中的共晶配體作為配體小分子，在AutoDock中設置相關參數(shù)，對接以后得到的構象，再與對接前的原配體的構象進行比較，以RMSD值來評價兩者之間相似度的差距。一般認為RMSD＜2?，才能說明對接后得到的構象與原配體差別較小，如果分子對接可以很好重現(xiàn)了復合物中蛋白與配體小分子的結合情況，即側面證明了分子對接方法可靠性較高。本課程的授課對象為藥學三年級的本科生，學生已學習過藥物化學、生物化學、藥理學等專業(yè)課程，具備一定的藥學專業(yè)知識基礎，也具有一定藥學實驗基礎。但是，部分同學初次接觸計算機輔助藥物設計軟件，專業(yè)外語的基礎薄弱，導致在學習藥物分子設計的軟件過程中會遇到許多困難。通過對以上學情的分析，筆者在本案例的教學過程中，首先通過雨課堂的方式把相關藥物分子設計的軟件操作教程提前發(fā)送給學生，并錄制軟件的操作視頻，讓學生課前充分地熟悉軟件的使用方法。在實際的課堂教學中，老師從小分子化合物庫的構建及預處理，蛋白大分子的下載以及優(yōu)化等最簡單的步驟開始演示，對學生的疑問進行現(xiàn)場解答。鼓勵學生自主學習與探索，采用小組交流討論，鼓勵同學之間互相幫助。通過這些舉措，學生可快速學會軟件的用法，顯著提高了學生的積極性和學習興趣。該教學案例的設計也融入藥物設計學課程考核中，是重要的考核內容。藥物設計學課程的成績組成為：期評成績=教學案例的課程作業(yè)+文獻報告+課堂表現(xiàn)+PPT制作及講解。我們要求學生在實施這個教學案例后，把分子對接的結果發(fā)送給老師，以及通過PyMOL和LigPLot軟件制作小分子與蛋白靶標的相互作用圖，通過PPT制作與講解，鼓勵和引導學生走上講臺，加深對知識點理解的同時，培養(yǎng)了學生分析解決問題能力、團隊協(xié)作能力以及表達能力。在課后調研過程中，學生均表示了對藥物設計軟件的歡迎，也有同學表示在老師課堂演示之后，分子對接實踐由學生自行開展，對軟件的安裝、熟悉和使用需要花費一定的時間精力，部分學生由于計算機基礎較弱，學習具體操作存在一定困難，而被卡在某操作環(huán)節(jié)，這個時候更加需要老師和同學幫助其解決技術難關。調研結果同時表明，學生很喜歡這種極具實戰(zhàn)性的藥物分子虛擬篩選的案例課程，也希望學校多配置高性能計算機，多開展專門的藥物設計軟件的系統(tǒng)培訓，從而幫助我校藥學專業(yè)學生更好地熟悉軟件的使用，提高學生藥物分子設計和虛擬篩選的能力。

3結語

本案例已運用于桂林醫(yī)學院藥物設計學課程的實際教學中，并取得了良好的教學效果。本教學案例設計的內容包括化合物庫的構建、靶蛋白的下載與預處理、小分子的結構獲取及優(yōu)化、AutoDock分子對接模型的建立，AutoDockvina虛擬篩選，以及利用PyMOL、LigPlot進行結果分析等實驗內容。通過本案例虛擬篩選的練習，學生們可以掌握基于免費的藥物設計軟件AutoDockvina來進行虛擬篩選，學會利用PyMOL和LigPlot軟件分析靶標蛋白與小分子相互作用模式，掌握計算機輔助輔助藥物設計的研究方法，為藥學專業(yè)本科生進行先導化合物的發(fā)現(xiàn)提供新的思路和手段，提升學生的藥物分子設計能力?？傊?，該教學案例的設計，加深學生對虛擬篩選的認識，并極大地提升了學生學習藥物分子設計的興趣，為未來從事藥物分子設計研究打下堅實基礎。

作者：譚相端 呂良 單位：桂林醫(yī)學院藥學院